超高效液相色谱技术在鸡蛋兽药检测中的应用

◎ 李 蕙

（临淄区检验检测中心，山东 淄博 255400）

由于仪器创新和色谱技术的改进，液相色谱技术在灵敏度、分离度和速度等方面实现了快速的发展和进步[1]。超高效液相色谱技术是在高效液相色谱技术应用的基础上，进一步提高了测控性能和指标，设计了承受能力更高的压力装置（色谱柱填充的小颗粒为1.7 μm，承受的流动相在15 000 psi），进一步提高了检测的灵敏度和反应时间[2]。目前，超高效液相色谱技术的应用场景正逐步得到扩展，特别是在医药学、化学工业和生物技术、食品领域、环境领域等得到了广泛使用[3]。近年来，不少国家对超高效液相色谱技术进行了探索，特别是在生命领域的研究更为深入，这也推动了超高效液相色谱技术的进一步创新。

1 超高效液相色谱的基本概念与技术特点

1.1 基本概念

超高效液相色谱技术是以范德米特方程（HETP=AdP+B/v+CdP2v）作为理论基础（HETP为理论塔板高度；A为涡流扩散系数；dP为填料粒径；B为分子径向扩散系数；C为传质因子；v为流动相线速度）。由该方程可得到颗粒度越小柱效越高；每个颗粒度尺寸有自己的最佳柱效流速；更小的颗粒度使最高柱效点向更高流速（线速度）方向移动，而且有更宽的线速度范围，所以降低颗粒度可提高柱效，也可提高速度。但是当固定相的粒度很小时，且维持最佳的线性速度时，高效液相色谱具备的快速分离和高效率的特点才会显示出来。因此，超高效液相色谱分析要达到最佳使用效果，除了柱内填充的颗粒小于2 μm 外，还需要具备以下几个条件，即提供快速的检测器、高压溶剂输送单元、快速自动进样器、控制系统和色谱系统等，这些将会使超高效液相色谱技术更为完善。

1.2 技术特点

1.2.1 高效色谱柱

色谱柱中装填的固定相的粒度对于色谱柱的性能至关重要。采用杂化颗粒技术能够合成新型的耐高压、全多孔球形反相固定相。运用新设计的筛板和装填技术，能够制备高效能的色谱柱。由于采用1.7 μm 颗粒，具备较高的优越性，而且还可以将柱长缩短原来柱长的1/3，也就是5 μm 颗粒色谱柱，效能也比原来提高了3 倍，既能够加快分离速度，还能将分离效能提高70%以上，而且峰容量和色谱柱也更窄。因此，超高效液相色谱技术在分析速度、效率和灵敏度上要比高效液相色谱技术更高效。

1.2.2 超高压输液泵

该输液泵装备了独立的柱塞驱动，并且还装置了能够实现4 种溶剂速度自由切换的二元高压梯度泵，能够为柱长10 cm 的固定相色谱柱提供1.0 mL·min-1的流速，而且耐高压能力达到105 MPa。在很宽的压力范围内，溶剂输送系统能够很好地弥补因为工作导致的溶剂压缩性变化，从而维系流速的稳定性。通过系统集成改进的高敏度真空脱气技术，可以推动进样器内的流动相溶剂脱气条件达到最高的试验条件。

2 超高效液相色谱技术在鸡蛋兽药分析领域的应用

2.1 药物成分分析与研究

超高效液相色谱技术具备高通量、速度快、灵敏度高等特点，常常和串联质谱技术、新型四极杆质谱系统技术等联用来进行常规分析。当超高效液相色谱和串联质谱技术联用时，能够加快代谢产物离子化的效率。相比于高效液相色谱技术，超高效液相色谱技术具备更高的检测灵敏度，即使低浓度的代谢产物也能够被检测出来。

超高效液相色谱和串联质谱联用技术在药物筛选中的应用表明，在高通量药物筛选上，超高效液相色谱技术的应用更深入、前景更广阔，能够大幅度缩短应用时间，提高灵敏度以及将生物样品不纯带来的分析干扰降到最低程度。MENSCH 等[3]在超高效液相色谱技术和串联质谱技术联用的条件下，可以检测出包括咖啡因在内的多种化合物。这种方法的检测限在0.61 ～12.00 nmol·L-1，并且处理量的速度提高了4 倍，增加了灵敏度，可以应用在早期的药物筛选中。HAVLÍKOVÁ 等[4]将高效液相色谱技术替换为超高效液相色谱技术，对氟氢可的松等4 种药物成分进行分析，结果发现超高效液相色谱技术分析速度是高效液相色谱技术的3 ～9 倍。

中药的成分比较复杂，超高效液相色谱技术与质谱联用，能够分析复杂的中药成分，并且还具有高通量、灵敏度高和准确性高等优势，在中兽药研发和推广上发挥了重要的作用。武为宝等[5]采用高效液相色谱技术对丹参中的药用成分，包括降鼠尾草氧化物、二氢丹参酮Ⅰ和丹参酮Ⅰ在内的5 种脂溶性成分进行了重点分析，发现在根及根茎中，这5种成分比较相近。曹悦等[6]采用超高效液相色谱技术对龙胆药材中的獐芽菜苦苷和龙胆苦苷的含量进行了测定。结果表明，龙胆苦苷的含量为56.75 ～86.61 mg·g-1，远高于《中国药典》规定；獐牙菜苦苷的含量在3.27 ～5.52 mg·g-1。杨俊等[7]利用超高效液色谱-蒸发光散法对黄芪甲苷进行测定，保留时间控制在2.1 min，出峰时间控制在12 min，能够很好地解决黄芪甲苷无法测定问题。

2.2 兽药残留检测

近些年来兽药残留问题频发，并且难以有效解决，其不仅对人们的身体健康造成负面影响，还长期困扰着畜禽产品的出口，导致畜禽产品出口受阻。近年来，不少学者在超高效液色谱技术检测兽药领域进行了相关探索，取得了大量的研究成果。李文杰等[8]利用UPLC-MS/MS 法对11 种喹诺酮类药物在虾产品中的残留进行了抽样分析，再利用C18色谱柱进行分离，结果发现这些药物的检出限均达到0.01 μg·kg-1，综合回收率甚至超过100%，最高能达到102%；而且相对偏差也能够达到1.6%～9.9%。该种方法具备简便、灵敏度高且快速等特征，适用性非常广。同样，黄子敬等[9]应用超高效液相色谱-串联质谱法对7 种磺胺类、3 种喹诺酮类及4 种硝基咪唑类兽药在畜禽肉中的残留进行了测定，综合应用效果较好。同样，李杏翠等[10]采用UPLC-MS/MS 法对畜禽产品中3 种磺胺的残留量进行了检测，效果非常灵敏。陈德莹等[11]采取超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱联用技术对兽药中的三聚氰胺残留量进行了测定。研究发现具备三聚氰胺分离状态良好且检测线性度好等特点，该方法回收率在80.23%～96.52%，检测线均小于2 ng·mL-1。该种方法处理程序简单，适宜于食品中低含量三聚氰胺的测定。

3 问题与展望

超高效液相色谱技术具有灵敏、快速等无可比拟的优点，这为鸡蛋兽药的研发和检测等提供了新的平台载体和思路。尽管优点较多，但是超高效液相色谱技术在实际应用中还存在一些问题和局限性，在一些关键技术环节上还需要改善和突破。超高效液相色谱技术超高通量的样品分析能力的提升，大幅度提升了样品的批处理效率，但样品前处理环节消耗时间较长，成为制约药品检测分析周期的一个明显的瓶颈[12]。因此，缩短样品前处理时长也成为需要解决的一大难题。目前，1.7 µm 颗粒度色谱柱的压力已经达到103.4 MPa，这种情况下如果降低颗粒度，将会使色谱柱的反压呈现几何级数倍增[13]。因此，当前状态下，通过降低色谱柱的颗粒度来提高色谱仪的分析效率已经不可实现，毛细管柱和检测芯片技术的应用成为液相色谱分析新的发展方向[14]。对于高效液相色谱技术来说，要想在鸡蛋兽药检测中进一步提高应用价值，还需要提高峰面积的重复性。另外，由于国外一些国家已经垄断了高效液相色谱的关键技术，使得仪器设备和试剂耗材等非常昂贵，实验室需投入的资金量较大，这也为该项技术在兽药研发和检测领域的推广造成了成本性的障碍因素。因此，研发适合我国的超高效液相色谱设备和耗材，降低成本，也成为当前国内超高效液相色谱技术开发和应用的关键因素之一。

4 结语

目前，超高效液相色谱技术在农产品检测中应用较为广泛，具有检测灵敏、速度快等特点。随着人们对农产品质量的要求越来越高，其在农产品检测领域将具备更加广阔的使用空间。