槲皮素-纳米银抗菌纱布的研制及体外抗菌实验研究

许林林 曹斐然 吴晓琴 邱华 王银龙

[摘要]目的：在紗布表面通过原位还原法制备槲皮素-纳米银复合抗菌涂层，并探究其抗菌效率及生物相容性。方法：利用槲皮素易溶于碱难溶于酸的特性，通过碱酸重析出的方法在纱布表面形成均匀的非晶包裹层，将其浸入硝酸银溶液中，制备出槲皮素-纳米银复合抗菌纱布。扫描电镜（Scanning electron microscope，SEM）观察样品表面形貌、X射线光电子能谱（X-ray photoelectron spectroscopy，XPS）分析表面元素组成、能量散布分析仪（Energy Dispersive Spectrometer，EDS）分析样品表面元素分布情况，琼脂平面扩散法试验、吸收法实验评价抗菌性能；通过CCK-8法评价（Cell Counting Kit-8）细胞毒性；利用结晶紫染色法在显微镜下观察细胞的数目形态。结果：SEM显示槲皮素-纳米银复合抗菌纱布组（Cotton gauze- quercetin/Ag group，CG-Q/Ag组）纱布表面形成光滑槲皮素包裹层，在槲皮素包裹层表面通过原位还原反应成功搭载了纳米银颗粒，EDS检测显示CG-Q/Ag组纳米银成功搭载在纱布纤维表面并且均匀分布；抗菌结果显示琼脂平面扩散法试验中CG-Q/Ag0.5、CG-Q/Ag0.1组周围有透亮的抑菌环，吸收法实验中CG-Q/Ag0.5、CG-Q/Ag0.1抑菌率＞95%优于其余各组，且差异具有统计学意义（P＜0.05）；CCK-8实验中显示CG-Q/Ag0.5具有良好的生物相容性；结论：槲皮素-纳米银复合抗菌纱布在实现有效抑菌能力时还具备良好的生物相容性，碱酸重析出法构建槲皮素非晶包裹层并且原位还原生成银纳米颗粒的策略为纱布载银改性提供了一种新的技术路线。

[关键词]槲皮素；纳米银；原位还原；绿色制备；抗菌活性；复合抗菌纱布

[中图分类号]R644    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2023）06-0112-06

Preparation of Quercetin Nano Silver Antibacterial Gauze and its Antibacterial Experiment in Vitro

XU Linlin，CAO Feiran，WU Xiaoqin，QIU Hua，WANG Yinlong

（Department of Stomatology/Affiliated Stomatological Hospital of Anhui Medical University，Anhui Provincial Key Laboratory of Oral Disease Research，Hefei 230032，Anhui，China）

Abstract： Objective  Quercetin nano silver composite antibacterial coating was prepared on the surface of gauze by in-situ reduction method. At the same time， its antibacterial efficiency and biocompatibility were explored. Methods  Taking advantage of the characteristics that quercetin is easy to dissolve in alkali but difficult to dissolve in acid， a uniform amorphous coating is formed on the surface of the gauze by alkali acid precipitation method. Then it was immersed in silver nitrate solution to prepare quercetin nano silver composite antibacterial gauze.The surface morphology of the samples was observed by scanning electron microscope （SEM）;the surface element composition was analyzed by X-ray photoelectron spectroscopy （XPS）;the antibacterial properties were evaluated by agar plane diffusion test and absorption test. Cytotoxicity was evaluated by CCK-8 method; Crystal violet staining was used to observe the number and morphology of cells under the microscope. Results  SEM showed that smooth quercetin coating layer was formed on the surface of CG-Q/Ag group gauze， and nano silver particles were successfully loaded on the surface of quercetin coating layer through in-situ reduction reaction. EDS showed that the CG-Q/Ag group nano-silver was successfully and uniformly loaded on the surface of the gauze fiber. In agar plane diffusion test， the antibacterial results showed that there were clear antibacterial rings around CG-Q/Ag0.5 and CG-Q/Ag0.1; the antibacterial rates of CG-Q/Ag0.5 and CG-Q/Ag0.1 in absorption test were better than those of other groups， and the difference was statistically significant （P＜0.05）;CCK-8 experiment showed that CG-Q/Ag0.5 had good biocompatibility. Conclusion  Quercetin-nanosilver composite antibacterial gauze has good biocompatibility while achieving effective bacteriostatic ability. Strategy， that use the alkaline acid reprecipitation method to construct the quercetin amorphous coating and in situ reduction to generate silver nanoparticles， provides a new green technical route for the modification of gauze carrying silver.

Key words： quercetin; nano silver; in-situ reduction; green preparation; antimicrobial activity; composite antibacterial gauze

目前，纳米银抗菌纱布因其良好的广谱抗菌效果在烧伤[1]、创伤的创面治疗中表现出良好的治疗效果，应用前景十分广阔。纳米银传统的制备方法包括物理方法和化学方法，但是这些所需设备技术要求高，生产成本高昂，而且在制备过程中使用到的有机溶剂可能会残留在纳米银颗粒之中影响产品的质量，存在潜在的环境和生物风险[2]，在一定程度上限制了纳米银在抗菌纱布制备中的应用[3]。因此，使用一种高效，简易，无害的方法在纱布表面原位还原制备纳米银抗菌纱布具有重要意义。槲皮素是一种多羟基黄酮类化合物，广泛存在于自然界中植物的花、果、叶实中，具有抗菌[4]、抗炎[5]、镇痛[6]、抗病毒[7]、抗癌、心血管保护及免疫调节等作用[8]。槲皮素易溶于碱难溶于酸，可利用此特性在纱布表面形成均匀一致的槲皮素非晶包裹层。

本实验首先通过碱液溶解槲皮素，然后浸润纱布，再将纱布迅速置入酸液中，通过重析出方法在纱布纤维表面构建均匀的非晶包裹层；再利用槲皮素还原硝酸银在纱布表面原位形成槲皮素-纳米银复合抗菌层，赋予纱布抗菌能力与良好的生物相容性，以期为构建载银纱布提供一条新的绿色技术路线。

1  材料和方法

1.1 主要材料及设备：GeminiSEM 300扫描电镜（ZEISS 公司，德国）；酶标仪（BiO-TEK公司，美国）；X射线多晶衍射仪（Rigaku，日本）；倒置显微镜（莱卡公司，德国）；精密电子天平（Sartorius，德国）；超纯水系统（RiOs8，美国）；微量移液枪（Eppendorf公司，德国）；高压蒸汽灭菌锅（HVE-50，日本）；高速离心机（北京六一，中国）；主要材料：医用纱布块（振德医疗，中国）；槲皮素；L-929小鼠成纤维细胞（上海细胞库，中国）；胎牛血清（Gibco，新西兰）；24 孔板（Hy Clone，美国）；其他化学试剂均购自国药集团。

1.2 脱脂纱布预处理：将普通医用脱脂纱布裁剪为4 cm×4 cm的正方形若干块，放入培养皿中备用设为普通纱布组（Cotton gauze group，CG组）。

1.3 制作抗菌纱布：向4 mg/L槲皮素悬浊液中滴入1 mol/L NaOH溶液使槲皮素恰好完全溶解，将碱性槲皮素溶液倒入培养皿中浸没纱布，再向培养皿中滴入1 mol/L HCl，待纱布表面形成一层槲皮素包裹层后，使用蒸馏水反复冲洗纱布表面多余试剂，烘干备用设为槲皮素-纱布组（Cotton gauze-quercetin group，CG-Q组）。将含槲皮素纱布分别浸泡在1 mg/L AgNO3、0.5 mg/L AgNO3、0.1 mg/L AgNO3、0.05 mg/L AgNO3、0.01 mg/L AgNO3中并放置在UV光下静置30 min后，使用蒸馏水反复冲洗纱布表面多余试剂，烘干即可获得槲皮素-纳米银复合抗菌纱布组（Cotton gauze-quercetin/Ag group，CG-Q/Ag组）样品。见图1。

1.4 样品表征：使用扫描电子显微镜观察附着在纱布上CG-Q/Ag的形貌特征及纳米银分布情况。

1.5 纱布的抗菌性能研究：参照纺织品抗菌性能评价中的琼脂平皿扩散法[9]，定性评价材料的抗菌性能。配制琼脂固体培养基，并在上表面均匀涂布金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S aureus）。将空白原始纱布和CG-Q/Ag抗菌纱布剪成1 cm×1 cm的正方形，将样品分为空白纱布对照组以及各浓度梯度试验组。将各组样品置于涂布菌液的培养基上，轻轻按压使样品与菌液充分接触，37℃培养24 h，测量抑菌带宽度。抑菌带宽度的计算公式为：A=（D-d）/2。式中A为抑菌带宽度/mm；D为抑菌带的外径平均值/mm；d为试样边长/mm。参照纺织品抗菌性能评价吸收法[10]，定量评价材料的抗菌性能。将经过24 h培养的菌液稀释至浓度为1×106～3×106 CFU/ml，取试验菌液150μl分布滴入实验组和空白对照组样品中，使样品完全浸透，培养条件为：（37±2）℃，时间24 h。在实验组和对照组中分别加入1 ml的肉汤，超声洗脱5 min，梯度稀释后取150 μl涂布于固体培养基上，培养条件为：（37±2）℃，时间24 h，计数。抑菌率的计算公式为：抑菌率（%）=（B-C）/B×100%。式中B为空白纱布对照组接种后培养24 h后的细菌数（CFU）；C为试验组细菌接种后培养24 h后的菌落数（CFU）。见表1。

1.6 纱布的生物相容性测试：用CCK-8法和结晶紫染色法检测槲皮素-纳米银复合抗菌纱布对L-929的细胞毒性，评价纱布的生物相容性。

1.6.1 CCK-8比色法：①将L-929细胞悬浮液以8×103个/孔加入96孔细胞培养板中，每孔200μl，先在37℃、CO2体积分数为5%的环境下培养24 h；②用完全培养液浸泡1 cm×1 cm空白对照组和实验组各浓度梯度纱布制取浸提液；③然后分别取200μl浸提液加入L-929细胞孔中，每种提取液重复4孔/板，其中空白纱布为对照组；④上述细胞放置于37℃、体积分数5% CO2条件下培养24、72、96 h，将10μl CCK-8溶液加入上述96孔細胞培养板细胞中，充分混匀，继续培养4 h。使用酶标仪在450 nm波长处测定各孔吸光度值，并计算均值，同时计算细胞相对增殖率。

1.6.2 结晶紫染色：将L-929细胞以4×104个/孔加入24孔细胞培养板中，先在37℃、体积分数5% CO2的环境下培养24 h。用含2%小牛血清的RPMIl640培养液浸泡1 cm×1 cm CG-Q纱布和空白纱布制取浸提液，然后分别取500 μl实验组和对照组浸提液加入L-929细胞孔中，每种提取液重复4孔/板。将上述24孔板放置于37℃、CO2体积分数为5%的环境下培养72 h。弃上清液，用PBS洗涤一次，每孔加入10%甲醇溶液0.5 ml固定30 s，吸尽甲醇溶液，每孔加结晶紫染液0.5 ml，静置20 min。用蒸馏水震荡洗涤各孔，将24孔培养板倒置于吸水纸直至干燥。在倒置显微镜下观察成纤维细胞形态、数目并拍照记录。

1.7 统计学分析：实验结果均以（x?±s）的形式表达。使用SPSS 16.0软件，三组及其以上比较用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2  结果

2.1 表面形貌表征：表面形貌结果电镜扫描结果见图2，结果显示普通脱脂纱布表面可见凹凸不平的纤维间隙；CG-Q组纱布表面形成槲皮素非结晶包裹涂层，该涂层均匀一致，表面光滑；CG-Q/Ag组在槲皮素包裹层表面搭载了纳米银颗粒，纳米银颗粒呈立方形，球形或柱状，平均粒径较小，约25 nm，纳米银颗粒均匀地分布在纱布纤维表面以及孔隙中。EDS能谱结果见图3，结果显示CG-Q/Ag组纱布表面检测出C、O、Ag元素，Ag元素在纱布均匀分布于纱布表面与间隙中。这与电镜扫描结果一致。

2.2 表面元素分析：利用X射线光电子能谱技术（XPS）对各组纱布表面进行分析，结果显示在各组样品中均观察到C1s峰及O1s峰；其中CG-Q组的C原子与氧原子比为68.42∶31.58高于CG组65.60∶34.40；纤维素化学式（C6H10O5）n，槲皮素化学式为C15H10O7，槲皮素碳氧比高于纤维素，CG-Q组较CG组碳氧比上升说明槲皮素成功搭载纱布表面。在CG-Ag组中，观察到Ag3 d衍射峰，纳米银成功搭载于纱布表面。见表4。

2.3 抗菌性能结果：琼脂平面扩散法结果显示，CG-Q/Ag0.01、CG-Q/Ag0.05、CG-Q/Ag0.1组均未见抑菌环，CG-Q/Ag0.1组虽未见抑菌环但其纱布底部见细菌数量与对照组样品相比略有减少；CG-Q/Ag0.5、CG-Q/Ag1组样品周围见透亮抑菌环，说明经过处理的复合抗菌纱布具有很好的抗菌效果。见图5、表2。吸收法抗菌结果显示CG组较空白组菌落较多并且其抑菌率小于0，可能是因为普通医用纱布表面无抗菌性并且为细菌提供了更多的附着位点，使细菌更容易生长繁殖。其余各组包括CG-Q组，均表现出一定的抑菌效果。其中CG-Q/Ag1与CG-Q/Ag0.5组抑菌效果最好，抑菌率＞95%。见图6。

2.4 生物相容性结果：在1 d时CG-Q/Ag0.5、CG-Q/Ag1较其余组细胞数量较少，但随着时间推移至3 d时CG-Q/Ag0.5组与其余各组差异无统计学意义（P＞0.05），5 d时CG-Q/Ag0.5、CG-Q/Ag1细胞数量均已达到正常水平，与其余组均无差异（P＞0.05）。CCK-8试验显示CG-Q/Ag0.5组短期内虽然会影响L-929成纤维细胞增殖，但随着时间延长，细胞数量显著增多。在培养72 h后，在倒置显微镜下观察到CG-Q/Ag0.5组L-929成纤维细胞单层紧密排列着，呈梭形、星形或不规则的多变形的正常形态，与其余组相比细胞数量未见明显减少，形态未见明显差别。见图7～8。

3  讨论

试验结果显示，涂层在纱布表面结合稳定牢固，在电镜下可以观察到在纱布表面生成了纳米银颗粒，且纳米银颗粒多为抗菌效果更好的立方形[11]，XPS和EDS能谱分析显示纱布表面Ag元素分布均匀，抗菌评价显示该纱布具有很好的抗菌性能，其中纳米银起主要抗菌作用，Ag+可使细胞壁和细胞质膜破裂和干扰细胞酶活性从而杀死细菌；另外槲皮素也通过改变细胞膜和细胞壁通透性和阻碍核酸和蛋白质的合成的起到一定的抗菌作用。CCK-8和结晶紫染色试验显示槲皮素-纳米银复合抗菌纱布具有良好的生物相容性。

纳米银因其独特的小尺寸效应和表面效应[12]不仅抗菌效果好范围广泛、持续杀菌时效长，稳定性好并且不易产生耐药性[13]。利用物理和化学的方法合成纳米银常常需要在苛刻的条件下进行，并且合成过程中常常需要使用到有毒的化学药剂，例如Gopiraman利用硼氢化钠在硝酸银水溶液中合成纳米银，并将其负载到纤维素纳米纤维上成功制备了载纳米银生物纱布，但是硼氢化钠经皮肤吸收后对人体具有一定有毒性作用[14]。Beltran等高通量和精密火焰喷雾合成方法成功合成纳米银颗粒，但是这类物理合成方法耗能较高，而且试验设备及操作程序非常复杂[15]。本实验通过碱酸重析出的方法在纱布表面形成槲皮素结晶层，将其浸入硝酸银溶液中，在纱布表面绿色地原位制备槲皮素-纳米银复合抗菌涂层。绿色法制备纳米银相较于传统化学和物理方法具有制备工艺简便、反应条件温和及生物安全性更好等优点。

细菌感染是影响伤口愈合的最常见的因素之一[16]，感染伤口的细菌一旦定值在伤口表面形成生物膜[17]，会使感染伤口转化为慢性伤口[19]，慢性伤口如果得不到及时正确的处理，细菌入血导致菌血症及败血症，甚至会发展成感染性休克，感染伤口经久不愈，增加了患者的痛苦和病死率[19]。金黄色葡萄球菌在慢性伤口形成中的作用卓著[20]，故本实验以金黄色球菌作为主要抗菌对象。在全身应用抗生素的疗法中，局部伤口处的药物浓度往往难以达到防治感染的有效水平，如果盲目增加药物剂量，会加重药物的不良反应，而且易产生耐药性[21]。因此，选择在伤口处使用高效，安全的纱布是一种有效的治療手段[22]。纳米银抗菌纱布因纳米银独特的小尺寸效应和表面效应，可通过破坏细胞壁，干扰脱氧核糖核酸（DNA）复制，降低生物酶的活性，从而达到抑菌的效果[23-25]。纳米银对革兰阳性菌、革兰阴性菌、真菌及部分病毒等均有抗菌作用，具有广谱抗菌效果[26]，甚至对耐药菌株都显示出很较强的抗菌效果。局部使用抗菌纱布不但能保护伤口起到暂时性屏障作用，又可以避免或控制伤口感染[27]。在治疗慢性伤口或者潜在的抗生素耐药菌时，槲皮素-纳米银复合抗菌纱的广谱抗菌性和独特的杀菌机制会发挥重要作用，但是该纱布缺少长期动物试验和临床试验，仍需探索研究。

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[收稿日期]2022-06-07

本文引用格式：许林林，曹斐然，吴晓琴，等.槲皮素-纳米银抗菌纱布的研制及体外抗菌实验研究[J].中国美容医学，2023，32（6）：112-117.