ZIF-8 负载的吲哚菁绿光热治疗常见菌感染的研究

鲁旭，杜亭亭，方远，王晓敏

（1.天津医科大学总医院保健医疗部，天津300052；2.天津科技大学食品科学与工程学院，食品营养与安全国家重点实验室，天津 300457；3.天津中医药大学中西医结合学院，天津 301617）

致病菌侵入宿主后，所产生的毒素和其他代谢产物能够引起局部或全身性感染[1]，严重情况下可造成脓毒血症、感染性休克等并发症，是造成全球范围内人类死亡的主要原因之一。全球每年超200万人因大肠杆菌（E.coli）感染死亡[2]，约20%的细菌性食物中毒由金黄色葡萄球菌（S.aureus）引起[3]。抗生素作为目前治疗细菌感染类疾病的首选药物，因过度使用和滥用，导致抗生素耐药菌株的出现，对人类健康造成了更大的威胁，敦促替代治疗手段加速普及。近年来，光热治疗（PTT）为抗菌治疗提供了新的途径。PTT 是通过光热试剂在近红外激光照射下，有效地将光能转化为热能并造成局部过热，从而杀死病原体，与传统抗菌方法相比，有效规避了细菌耐药性问题并能实现多策略协同治疗[4]。光热试剂吲哚菁绿（ICG）是一种具有较高的光热转换效率的两亲性碳菁染料，广泛应用于光热治疗[5]、光动力治疗[6]和荧光实时成像[7]等领域。然而ICG 极易受生理条件下分子自聚集和近红外照射下光热降解等因素干扰而大幅降低自身治疗性能[8]，严重制约了其实际应用前景，改良方案却鲜有报道。类沸石咪唑酯骨架材料（ZIF）是一种具有四面体拓扑构型的类沸石结构材料，由Zn 或Co 与咪唑类配体组成[9]，化学稳定性高，在高温及水环境下可以保持稳定的框架结构[10]。为此，本研究选择具有良好稳定性、生物相容性、低细胞毒性的金属有机框架材料ZIF-8 负载ICG，通过便捷一步法构建出PTT 性能稳定优良的ZIF-8@ICG 纳米复合颗粒，在治疗E.coli和S.aureus等常见菌感染的验证实验中展现理想效果，为ICG 的临床应用提供了有效思路。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 实验材料

ICG（纯度为99%）购于西格玛奥德里齐公司；无水乙醇、无水甲醇（天津化学试剂一厂）；金黄色葡萄球菌、大肠杆菌（北京鼎国生物技术公司）；六水合硝酸锌（上海麦克林生化试剂有限公司）；二甲基咪唑（上海阿拉丁科技有限公司）；NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4（国药集团化学试剂有限公司）；酵母提取物、胰蛋白胨（青岛海博生物科技有限公司）。

1.1.2 主要仪器

红外热像仪（FLIR E50，东方嘉仪电子科技有限公司）；近红外光热转换装置（FC-808，上海熙隆光电科技有限公司）；集热式恒温加热磁力搅拌（DF-101D，巩义市予华仪器有限责任公司）；UV-vis 吸收光谱仪（UV-1800，岛津公司）；恒温震荡箱（HAQ-F，哈尔滨东联电子技术有限公司）；微量台式高速离心机（H1650-W，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；涡旋振荡器（MX-S，Scilogex）；超声波清洗机（SB-120DT，宁波新芝生物科技股份有限公司）；超纯水系统（Millipore Milli-Q，Elix Technology Inside）；电子分析天平（BT25S，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）

1.2 方法

1.2.1 ZIF-8@ICG 纳米复合颗粒的制备

用分析天平精确称取0.05 g 的ICG 和0.148 g 的六水合硝酸锌，加入10 ml 甲醇溶液。将其放到超声处理装置中使其充分溶解，得到溶液A。用分析天平精确称取0.328 g 二甲基咪唑和0.05 g 的ICG，加入10 ml 甲醇溶液，将其放到超声处理装置中使其充分溶解，得到溶液B。然后将溶液B 在室温条件下倒入溶液A 中，将其放置于搅拌速度为600 rpm 的磁力搅拌器上，在室温下搅拌1.5 h 充分反应。将产物放到离心机中，经11 000 rpm 离心5 min 后，用无水甲醇洗涤数次，得到绿色ZIF-8@ICG 粉末（0.43 g；产率93.5%）。

1.2.2 ZIF-8@ICG 纳米复合颗粒的表征

使用浓度为10 mmol/L 的甲醇溶液作为缓冲液，分别配制ICG 溶液、ZIF-8 溶液、ZIF-8@ICG 溶液，使用紫外可见吸收光谱仪检测样品的吸光度，检测波长范围为400～900 nm。

1.2.3 光热转化性能测定

配制不同浓度的ZIF-8@ICG 溶液（0.05、0.1、0.2、0.5 和1 mg/ml）。取样后经808 nm，1.5 W/cm2的近红外光分别照射5 min。用红外热像仪记录不同溶液的温度随时间变化的关系，并每隔30 s 拍摄对应图片记录不同样品的升温情况。

1.2.4 光热循环稳定性测试

分别取ZIF-8@ICG 溶液和ICG 溶液接受808 nm，1.5 W/cm2的近红外光照射5 min，每隔30s 用热成像仪拍照，记录对应的温度变化。待样品慢慢冷却恢复室温后再用相同功率激光照射5 min，每30 s 记录一次温度变化，共往复3 次升降温循环。通过ZIF-8@ICG 与ICG 的热循环稳定性的对比，来研究ZIF-8@ICG 和ICG 的光热稳定性。

1.2.5 光热杀菌性能测试

将PBS 缓冲液、ZIF-8 溶液、ICG 溶液、ZIF-8@ICG 溶液分别与1×106CFU/ml 金黄色葡萄球菌和大肠杆菌悬浮菌液混合，每个菌种抗菌实验各分为8 组：PBS 对照组、PBS 实验组、ZIF-8 对照组、ZIF-8 实验组、ICG 对照组、ICG 实验组、ZIF-8@ICG 对照组、ZIF-8@ICG 实验组。实验组均接受808 nm，1.5 W/cm2的近红外光照处理20 min，对照组无光照处理。随后取样涂布于LB 固体培养基中37 ℃恒温培养12 h，分别记录各组金黄色葡萄球菌/大肠杆菌的菌落数量，并比较实验组样品和对照组样品的灭菌效果。

1.3 统计学方法

采用SPSS 25.0 软件进行数据分析。符合正态分布的计量数据以（±s）表示，多组间比较采用方差分析，组间多重比较用LSD-t 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ZIF-8@ICG 纳米复合颗粒的表征

由图1 可知，ZIF-8@ICG 纳米复合颗粒在660～860 nm 之间有吸收，其中在782 nm 处有特征峰，与ICG 的吸收峰型（在780nm 处有特征峰）相似，同时因与此范围内无特征性吸收峰的ZIF-8 负载稀释了单位浓度的绝对含量，纳米复合颗粒的吸收强度弱于相同浓度的ICG 对照组，上述数据均证明ICG已与ZIF-8 形成稳定的ZIF-8@ICG 纳米负载结构。

图1 ICG、ZIF-8@ICG 和ZIF-8 的紫外可见吸收光谱

2.2 ZIF-8@ICG 的光热性能测试

ZIF-8@ICG 溶液（0.2 mg/ml）经过5min 的近红外光照射（808nm，1.5 W/cm2）温度可升高30.4℃，浓度升高至1 mg/ml 的溶液最高温度可达到72.3℃，而对照组纯水仅升高了2.4℃。同时拍摄的热值图亦显示了相同的结果，ZIF-8 的包裹负载作用对ICG 结构将近红外光能转化为热能的过程无不良影响，ZIF-8@ICG 整体结构具有良好的光热转化性能，见图2A、2B。

图2 ZIF-8@ICG 的光热性能测试

2.3 ZIF-8@ICG 与ICG 光热循环稳定性对比实验

经过近红外激光（5 min ，808 nm，1.5 W/cm2）第1 个照射周期后，ZIF-8@ICG 纳米复合颗粒和未经负载的ICG 的温度分别升至56.3 ℃和55.7 ℃。经第2 个激光照射周期后，未经负载的ICG 最高温度仅为37.2℃，且还在持续减弱，说明其受自聚集和光热降解等因素影响光热转化性能已大幅降低。与之相比，在经历了第2、3、4 个激光照射周期后，ZIF-8@ICG 纳米复合颗粒的最高温度仍旧升高至50 ℃、47.1 ℃、43.6℃，表明ZIF-8@ICG 纳米复合颗粒有效增强了光热稳定性，改善了ICG 分子溶液中自聚集的问题，具有更加理想的实际应用价值，见图3。

图3 ZIF-8@ICG 与ICG 光热循环稳定性对比实验

2.4 ZIF-8@ICG 纳米复合颗粒的光热杀菌实验

经近红外光（808 nm，1.5 W/cm2）照射后，ZIF-8@ICG 纳米复合颗粒对S.aureus和E.coli的杀菌率分别为99.97%和99.91%，优于未经负载的ICG对照组（80%和85%），差异有统计学意义（P＜0.001），见图4～图6。

图5 ZIF-8@ICG 和ICG 光热处理后金黄色葡萄球菌的存活菌落图

图6 ZIF-8@ICG 和ICG 光热处理后大肠杆菌的存活菌落图

3 讨论

3.1 ZIF-8@ICG 纳米复合颗粒的光热性能及其循环稳定性研究

ICG 因其良好的组织渗透性、生物安全性及光热转换效率等特性[13，14]，是被美国药物管理局（FDA）批准的应用于临床研究的唯一一种近红外光热试剂[15]，在PTT 抗癌[16]、抗菌[17]等领域得到广泛研究，然而ICG 稳定性较差且在人体内的半衰期短，严重影响其光热治疗效果，因此，通过提高ICG 稳定性以加强其光热杀菌效果具有重要意义。本研究通过ZIF-8 中Zn2+与ICG 磺酸基的配位作用制备出ZIF-8@ICG 纳米复合颗粒，并通过紫外可见吸收光谱表征验证其负载结构的稳定性。通过光热转化实验发现，在808 nm 近红外光照射下，ZIF-8@ICG 溶液的升温曲线与浓度呈正相关，且在1 mg/ml 浓度下最高温度可达到72.3℃，ZIF-8@ICG 整体结构具有良好的光热转化性能，可用于进行细菌的光热灭活。通过热循环稳定性对比还发现，ZIF-8 的包覆作用显著增强了ICG 的光热稳定性，避免了溶液中ICG 分子自聚集现象，历经4 次循环利用后仍产生20℃以上的升温效果，保持了良好稳定的光热转化性能，具有更加理想的实际应用价值。

3.2 ZIF-8@ICG 纳米复合颗粒的光热杀菌性能研究

世界卫生组织（WHO）于2017 年提出亟须研发针对S.aureus和E.coli等具有高感染性和高致死率的多发耐药菌的治疗新方案[11]。与传统抗生素疗法相比，PTT 回避了耐药性问题。作为PTT 的治疗核心，光热转换剂能够通过近红外激光照射有效地将光能转化为热能，从而直接杀死病原体[12]。本研究通过光热杀菌实验发现，在近红外光照射后，ZIF-8@ICG纳米复合颗粒对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的杀菌率均接近100%，明显优于未经负载的ICG 对照组。以上结果均证实ZIF-8@ICG 溶液吸收近红外激光的能量后将光能转化为热能，升高的溶液温度杀灭了金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，且灭菌效果显著，达到了基于ZIF-8@ICG 纳米颗粒光热杀菌的目的。

3.3 总结与展望

利用ZIF-8@ICG 纳米复合颗粒构建的新型光热杀菌疗法，操作简便，可重复利用，光热稳定性好，具有高效的光热转化性能，经近红外激光照射后对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌等常见菌感染展现出理想的光热杀菌效果。由于PPT 疗法物理特性的治疗机制，在治疗细菌感染（特别是耐药菌感染）中具有极强的广谱性并避免新的耐药菌产生，ZIF-8@ICG 疗法有望产生临床转化及应用价值。