响应面法优化萱草花总生物碱的提取工艺*

李盈，杨新惠，王琪

（1.石河子大学第一附属医院药学部，新疆 石河子 832002；2.新疆植物药资源利用教育部重点实验室/石河子大学药学院，新疆 石河子 832002）

百合科萱草属植物萱草（Hemerocallis fulvaL.），是民间传统常用的中草药，在我国各地栽培，根、茎、叶、花，均可入药[1]。在民间传统药品使用中，萱草常用于醒脑安神、养血美颜、清热解毒、通乳等[2]。近年来研究发现[3，4]，萱草具有抗肿瘤、抗菌、抗吸血虫、镇静催眠、抗抑郁、护肝保肝等药理作用。且萱草中生物碱成分丰富，药理活性好[5]。另有研究表明，萱草中含有秋水仙碱等生物碱类成分，具有减轻炎性反应而起止痛作用的生物活性[6]。本研究分别运用加热回流法和超声辅助法提取总生物碱，在单因素的基础上，采用响应面法对萱草花总生物碱的提取工艺进行优化，为该种植物的合理利用提供实验理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药材

萱草干花2 kg，在新疆百草堂药业集团购得。（R）-Jatropham （由本课题组前期实验中，在此植物中所分离的化合物，因该单体化合物所得含量可以满足此实验需求，并且纯度达到标准品所需，故选用该化合物为标准品），见图1。

图1 （R）-Jatropham 结构式

1.1.2 试剂

无水乙醇、二氯甲烷（天津市富宇精细化工有限公司）；浓盐酸（四川西陇化工有限公司）；其余化学试剂均为国药集团的分析纯。

1.1.3 仪器

FW-100 型高速万能粉碎机、DZKW-0-2 型电热恒温水浴锅（北京市永光明医疗仪器有限公司）；V-2401PC 型紫外-可见分光光度计（日本岛津）；N-1300 型旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司，东京理化器械株独资工厂）；KQ-500DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Sartorius BS110s 型万分之一电子天平（北京赛多利斯天平有限公司制造）。

1.2 方法

1.2.1 标准曲线绘制

参考文献[7-10]，精确称取本实验室自提纯（R）-Jatropham 标准对照品16.25 mg，用无水乙醇溶解定容至250 ml。精密吸取对照品溶液0.30、0.45、0.60、0.75、0.90、1.20 ml 添加至10 ml 容量瓶里面进行定容处理。以0.90 ml 对照品溶液测最大吸收波长，无水乙醇为空白，于206 nm 波长处对吸光度A 进行测定，对照品溶液浓度C、吸光度值A 分别为横坐标、纵坐标，以此完成标准曲线的绘制。得回归方程为A=0.0879 C+0.0363，R2= 0.9993，线性范围1.95～7.80 μg/ml。

1.2.2 萱草花总生物碱的提取工艺及提取量计算

萱草花经阴干粉碎后，过60 目筛。称量萱草花粉末2.0 g，根据条件加入乙醇溶剂进行超声，抽滤，滤液旋干，加入约20 ml 1% HCl 使其溶解，超声1 min，加入2.0 mol/L NaOH 约4.0 ml，pH 值调到10～11，然后对其进行过滤处理，30 ml 二氯甲烷对滤液进行萃取，重复3 次，萃取液合并，旋干，浸膏用乙醇溶解，定容，即得萱草花总生物碱。按照绘制（R）-Jatropham 标准曲线的方法，测定萱草花总生物碱的吸光度A 值，根据式1 得出萱草花总生物碱的提取量。

式中：C、V、M 是萱草花总生物碱质量浓度（μg/ml）、萱草花总生物碱定容后体积（ml）用萱草花粉末质量（g）。

1.2.3 实验设计

通过Box-Behnken 中心组合实验设计不断优化萱草花总生物碱提取工艺，以萱草花总生物碱提取含量为响应值，Design-Expert10 软件进行实验设计和数据分析，建立回归模型。

2 结果

2.1 单因素实验

本研究首先通过超声时间、超声温度、乙醇浓度及物料比等因素进行分析，确定实验因素与水平，然后进行响应面分析实验设计。

2.1.1 不同超声时间对萱草花总生物碱提取量的影响

精密称量萱草花粉末5 份，每份1.0 g，分别加入75%乙醇，物料比1∶10（g/ml），温度为40℃，采用“1.2.2”的方法提取萱草花总生物碱，对不同超声时间（10、15、20、25、30 min）带给萱草花总生物碱提取量相应影响情况加以评价。如图2 所示，随着超声时间的逐渐增大，提取出的总生物碱含量先增加，在15 min 时出现最大值，后又减小，后又转折增大，按照线性趋势，后面时间有可能继续增大超过15 min 的最大值，但是因时间因素以及仪器成本、损耗因素，超声时间初步选为15 min。

图2 超声时间对萱草花中总生物碱提取量的影响

2.1.2 不同超声温度对萱草花总生物碱提取量的影响

精密称量萱草花粉末5 份，每份1.0 g，分别加入75%乙醇，物料比1：10（g/ml），时间为25 min，采用“1.2.2”的方法提取萱草花总生物碱，评价不同超声温度（25、30、35、40、45℃）对萱草花总生物碱提取量的影响。如图3 所示，超声温度慢慢升高，提取出总生物碱含量先增后减，超声温度达35℃，所提取总生物碱含量居于最高水平，主要与超声温度升高过程中，一些杂质析出影响了生物碱的提取[11]，因此超声温度设为35 ℃。

图3 超声温度对萱草花中总生物碱提取量的影响

2.1.3 不同乙醇浓度对萱草花总生物碱提取量的影响

精密称量萱草花粉末5 份，每份1.0 g，物料比1：10（g/ml），时间为25 min，温度为40 ℃，采用“1.2.2”的方法提取萱草花总生物碱，对不同浓度溶剂（55%、65%、75%、85%、95%）带给萱草花总生物碱提取量相应影响情况加以评价。如图4 所示，乙醇浓度慢慢升高，萱草花总生物碱提取量不断升高。乙醇浓度达75%，萱草花总生物碱提取量峰值也将出现。随着乙醇浓度继续增加总生物碱提取量下降，这可能是因为乙醇浓度继续增加时一些挥发油或糖类等极性较低的物质被提取出来，从而影响了生物碱溶出，降低生碱的提取量[12]，因此选75%乙醇为提取溶剂的浓度。

图4 乙醇浓度对萱草花中总生物碱提取量的影响

2.1.4 不同物料比对萱草花总生物碱提取量的影响

精密称量萱草花粉末5 份，每份1.0 g，分别加入75%乙醇，时间为25 min，温度为40 ℃，采用“1.2.2”的方法提取萱草花总生物碱，评价不同物料比（1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16 g/ml）对萱草花总生物碱提取量的影响。如图5 所示，随着提取溶剂量的增加萱草花总生物碱的提取量随之增加。固定乙醇浓度为75%，当料液比为1∶10 时，总生物碱提取量出现峰值。继续增加料液比，总生物碱提取量开始下降。出现这种现象的原因可能是随着溶剂体积的增大导致对萱草花的超声不充分[13]，因此选1∶10（g/ml）为提取物料比。

图5 物料比对萱草花中总生物碱提取量的影响

2.2 响应面法优化萱草花总生物碱提取结果

2.2.1 中心组合因素设计及结果分析

进一步结合单因素试验结果显示，选取乙醇浓度（A），超声时间（B），物料比（C）和超声温度（D）为自变量，萱草花总生物碱提取含量（Y）为响应值，通过Design-Expert 10 软件的Box-Behnken 完成响应面中心组合设计，对萱草花药材总生物碱提取工艺加以优化。因素水平及编码见表1，试验设计方案及结果见表2，方差分析见表3。把表2 中数据通过Design-Expert 10 软件完成多元模拟拟合分析，即可获得以萱草花药材中总生物碱提取量为目标函数二次回归方程：Y=2.54+0.1A-0.041B+0.026C-（3.333E-003）D-0.075AB+0.017AC+0.027AD-0.033BC+0.065BD+0.017CD-0.58A2-0.082B2-0.12C2-0.12D2。表3 结果显示，模型的拟合度值为P＜0.0001，证明模型拟合度极显著，可以理想的拟合各因素对萱草花总生物碱提取量的影响结果，模型的失拟项为0.4670，P＞0.05，代表失拟项不显著，说明此模型的实验误差相对较小。根据响应面结果可对相关因素对总生物碱提取含量带来影响大小排序是：乙醇浓度（A）＞超声时间（B）＞物料比（C）＞超声温度（D）。

表2 响应面设计方案与结果

表3 回归方程方差分析

2.2.2 响应面分析

响应面法在对自变量最优值进行实际确定过程速度快、效率高的优势较为突出，为得响应值最大化提供重要保障[14]。相关因素间两两交互也会影响萱草花中总生物碱提取含量结果，根据响应面图与等高线图将其直观反映出来，曲面坡度与等高线形状对交互作用强弱具有直接决定影响，曲面坡度陡峭，等高线呈椭圆形代表两个因素交互作用极强，反之较弱。本实验响应面图和等高线图见图6～图11。可知，随着各因素的增加，总生物碱提取含量是呈先上升后下降的趋势，当溶剂浓度为75%，提取时间为15 min，物料比为1∶10（g/ml），超声温度为35 ℃时达到最大值。图6 响应面的坡度趋势较陡，等高线为椭圆形，说明乙醇浓度与超声时间交互作用较强，对萱草花总生物碱的提取有显著影响，乙醇浓度曲线比提取时间曲线陡峭，说明乙醇浓度对总生物碱提取的影响大于超声时间（A＞B）；图7响应面斜率较陡，等高线为椭圆形，表示乙醇浓度与物料比的交互作用较强，对总生物碱提取量有显著影响，乙醇浓度对生物碱提取量的影响曲线相对物料比的曲线趋势较陡，表明乙醇浓度对生物碱提取量的影响较大（A＞C）；图8 响应面斜率较陡，等高线呈椭圆形，说明乙醇浓度与超声温度的相互作用较强，对萱草花中总生物碱的提取量影响也较大。乙醇浓度的响应曲面比超声温度的曲面陡峭，说明乙醇浓度对总生物碱的提取量的影响比温度的影响大（A＞D）；图9 响应面的坡度较前面三个缓和，等高线较前三个偏圆，说明超声时间与物料比也有交互作用，对提取物中总生物碱提取量也有影响，超声时间的曲面相对于物料比趋势较陡，说明超声时间对提取物中总生物碱提取量的影响比物料比显著（B＞C）；图10 响应面坡度相对缓和，等高线呈圆形，由此能够看出超声时间和超声温度交互作用并不强，对给萱草花中总生物碱提取量的影响也十分有限，超声时间相对于超声温度趋势较陡，说明超声时间对提取物中总生物碱提取量的影响比超声温度显著（B＞D）；图11 响应面的坡度较缓和，等高线近似圆形，说明物料比与超声温度交互作用很弱，对萱草花中总生物碱提取量影响较弱，物料比的曲面相对于提取温度趋势较陡，说明物料比对提取物中总生物碱提取量的影响比超声温度显著（C＞D）。因此从响应面的陡峭程度可以看出，乙醇浓度对萱草花中总生物碱提取量的影响最显著，其次是提取时间，接着是物料比，最后是超声温度（A＞B＞C＞D），与方差分析结果一致。

图6 乙醇浓度与超声时间对萱草花总生物碱提取含量的响应曲面及等高线图

图7 乙醇浓度与物料比对萱草花总生物碱提取含量的响应曲面及等高线图

图8 乙醇浓度与超声温度对萱草花总生物碱提取含量的响应曲面及等高线图

图9 超声时间与物料比对萱草花总生物碱提取含量的响应曲面及等高线图

图10 超声时间与超声温度对萱草花总生物碱提取含量的响应曲面及等高线图

图11 物料比与超声温度对萱草花总生物碱提取含量的响应曲面及等高线图

2.2.3 验证实验

软件Design-Expert10 分析计算最佳提取条件：超声时间15 min，乙醇浓度75%，物料比1∶10（g/ml），超声温度35 ℃；选择上述提取工艺，采用相同方法提取3 批样品进行验证，测定萱草花总生物碱提取含量为2.58 mg/g，验证实验结果表明，优选的提取工艺是稳定可控的。

3 总结

此实验利用紫外-分光光度法完成萱草花总生物碱提取量测定方法的构建。首先采用单因素实验筛选影响萱草花中总生物碱提取量的各种因素，在此基础上，再利用中心组和响应面法试验对其提取工艺进行了优化，进而所得总生物碱最佳提取工艺条件：超声时间15 min、乙醇浓度75%、物料比1∶10（g/ml）、超声温度35℃；在此条件下，总生物碱提取量为2.58 mg/g，验证实验的结果与理论预测值相符较好。本研究确定了萱草花总生物碱的提取工艺，为进一步有效开发萱草及企业提取利用，提高效率奠定了实验基础。