酒精依赖大鼠不同戒断期血浆食欲素A 水平变化与戒断症状程度的相关性研究*

李子童，刘旭，李斌，陈旭**

（1.济宁医学院精神卫生学院，山东 济宁 272067；2.山东省精神卫生中心成瘾医学科，山东 济南 250014）

酒精依赖（Alcohol dependence）是由于饮酒所致的对酒精渴求的一种心理状态，可呈连续性或周期性出现，以体验饮酒的心理效应，在美国所有疾病中死亡率占2.6%[1]。临床上酒依赖患者在完全或部分停止饮酒后所出现的一组戒断症状如震颤、幻觉及意识障碍等，称为酒精戒断综合征（alcohol withdrawal syndrome，AWS）。AWS 期间，自主神经功能亢进可以出现恶心、呕吐、心率和血压变化等躯体症状和体征，严重者还可出现癫痫和水电解质紊乱，最终导致死亡或脑损害[2，3]。食欲素A（orexin-A，OXA）是外侧下丘脑神经元中的一种神经递质，其在饮酒、进食、内分泌功能和睡眠/觉醒的调节中发挥重要作用[4]。近年来越来越多的国内外研究表明，OXA 可能在物质成瘾方面发挥着重要作用。有动物研究发现[5]，大鼠海马区有着相当丰富的OXA 受体，而使用orexin 受体拮抗剂SB-334867 可以通过作用于吗啡依赖大鼠的海马的背侧区，来减少吗啡戒断症状中的牙齿打颤、身体发抖、腹泻、上睑下垂等一些躯体症状。同时临床研究中显示[6]，酒依赖患者的外周血中OXA 的蛋白表达和启动子的甲基化同戒断反应的严重程度呈负相关，即戒断反应越强，外周血OXA 的蛋白表达和启动子甲基化就越弱，这个结果可能提示外周OXA 的高水平抑制了其自身的合成。还有研究表明[7，8]，男性酒精依赖患者戒断后的外周血浆OXA 水平显著高于正常人，以及OXA 水平与患者的戒断症状和心理渴求之间存在正相关性。故本研究将以建立酒精依赖大鼠模型为基础，进一步观察并验证OXA 与AWS 的相关性，从而明确其对酒精依赖大鼠模型急性戒断症状的影响及治疗价值，为评估和治疗AWS 提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

选取雄性SD 大鼠24 只[（250±10）g 左右，（6±1）周龄]，对其进行编号、称重并依照随机数字表法分为A、B、C 三组（各组n=8），A 组为对照组，B 组和C 组为实验组。大鼠均由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供。本研究经山东省精神卫生中心伦理委员会审核批准。

1.1.2 实验试剂

使用75%医用酒精配制成6%的酒精水溶液。

1.2 实验方法

1.2.1 酒精依赖大鼠模型建立

每只大鼠单笼饲养，室温控制在20～25 ℃，同时12 h 人工模拟昼夜交替，普通固体营养颗粒饲料，24 h 自由饮食。参照李菁等[9]人的方法，将实验组饮水更换为含有6%的乙醇水溶液作为唯一引用水来源喂养28 d。对照组给予普通饮用水，自由进食。所有大鼠水源每3～4 d 更换1 次，每2 周称重1 次，至实验结束。

1.2.2 乙醇水溶液饮用量记录

实验组每次更换乙醇水溶液时，均记录大鼠酒精水溶液消耗量，直至实验结束汇总。

1.2.3 戒断症状评分

参照李菁等[9]人的方法，使用《酒精依赖大鼠戒断行为体征和听源性癫痫发作评分标准》（表1）进行评估，三组大鼠喂养28 d 后，将实验组笼内酒精水溶液更换为正常饮水，B 组和C 组分别于停酒后6 h、18 h，A 组于停水后6 h 进行戒断症状评分。

表1 酒精依赖大鼠戒断行为体征和听源性癫痫发作评分标准

1.2.4 样本采集

取血方式采用腹主动脉取血法，抓取大鼠后给予10%水合氯醛腹腔麻醉，待大鼠充分麻醉后将其固定于仰卧位实验台上，四肢用橡皮筋固定，切开腹部皮肤及筋膜，充分暴露大鼠腹腔寻找腹主动脉。使用静脉采血针进行采血，EDTA 抗凝保存并离心处理（3000 r/min，10 min），取上层血浆500 μl 于离心管中-70 ℃冻存。

1.2.5 酶联免疫吸附法测定（Elisa）样本OXA 水平

使用双抗体夹心法测定，恒温箱孵育30 min 后再加入终止液15 min 内，在450 nm 波长处测定吸光度并读数，每样本均采用双测法，取2 次测定的算术平均值作为OXA 最终测定浓度。上述样本均进行双测，取算术平均值作为最终测定结果。试剂盒购买自江苏酶免实验有限公司，按照说明书操作。

1.3 统计学方法

采用SPSS 26.0 统计学软件进行数据分析，如符合正态分布，以（±s）描述，两组比较采用独立样本t检验；如不符合正态分布，则以[M（QL，QU）]描述，组间比较用Kruskal-Wallis H 检验，结果采用Bonferroni 法校正。OXA 浓度水平与戒断症状评分相关性采用Spearman 相关分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 饮酒期间大鼠饮酒量和体重变化

B 组饮酒量与C 组比较[（958.75±89.83）ml vs（879.25±133.73）ml]，差异无统计学意义（P＞0.05）；每只大鼠平均每天饮酒量为32.82 ml/d，相当于摄入酒精1.58 g/d，见图1。实验前A 组体重为（247.41±7.67）g，与B 组 的（248.09±3.52）g 和C 组的（249.14±4.49）g 比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；实验结束A 组体重为（413.83±15.49）g，与B 组的（408.38±31.14）g、C 组的（427.35±17.22）g 比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见图2。

图1 不同戒断组大鼠饮酒量比较

图2 三组大鼠体重变化比较

2.2 酒精戒断后的酒依赖大鼠戒断反应评分

在建模期间，大鼠性格温顺，不易激惹，体征正常。自撤除酒精后2 h 开始，大鼠开始出现较多的戒断症状，如易激惹、具有攻击性、打喷嚏等。将戒断评分进行总体与分类比较，结果显示B 组戒断总分、分项评分与A 组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；C 组戒断总分与A 组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），但在分项比较中大鼠激惹性和尾巴强直两项评分与A 组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），其余三项评分比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表2、图3。

图3 各组大鼠戒断评分比较

表2 撤除酒精后各组大鼠戒断症状评分（n=8）

2.3 OXA 水平结果分析

将三组血浆OXA 测定结果进行对比，结果显示B 组血浆OXA 浓度水平高于A 组和C 组，差异有统计学意义（P＜0.05），C 组OXA 水平也高于A 组，但差异无统计学意义（P＞0.05），见图4。

图4 各组大鼠OXA 浓度水平比较

2.4 OXA 水平与戒断症状评分、饮酒量及体重变化相关性

将B 组和C 组的OXA 水平与戒断症状评分进行相关性分析，结果显示OXA 水平与戒断反应评分呈正相关性（r=0.70，P＜0.05），而与饮酒期间大鼠的体重变化、饮酒量无相关性（P＞0.05）。

3 讨论

酒精戒断综合征是酒依赖患者的饮酒中断，进而出现一系列精神及躯体症状，严重影响患者身心健康，也是戒除酒依赖的关键。目前，FDA 已批准了Orexin 受体拮抗剂用于治疗失眠[10]，以及其他Orexin 受体拮抗剂在临床应用研究，为治疗AWS 提供了一个新思路。本研究通过建立酒精依赖大鼠模型，探讨OXA 水平与酒精戒断症状严重性的相关性，从而为防治AWS 探寻新的临床线索。

3.1 饮酒期间大鼠饮酒量及体重变化

目前，酒依赖大鼠模型的建立多采用模拟酗酒者的方法，给予大鼠短期大量的酒精以达到酒依赖程度[11]。本研究采用长期给予大鼠低浓度酒精水溶液的方法建模，并同时设立同等健康对照大鼠，记录大鼠的饮酒量与体重变化，结果显示在仅改变饮水而其他喂养条件一致时，实验组与对照组大鼠的体重变化之间无明显差异，这表明长期饮用6%的低浓度酒精并不会影响大鼠的进食。因此，本研究分析实验组大鼠出现的戒断体征与OXA 浓度的差异，仅仅是由于长期饮酒所造成的。同时本研究对比了两个实验组的饮酒量，发现并无明显差异，从而排除了实验组之间的结果差异并非是由于酒精消耗量的不同引起的。

3.2 戒酒后大鼠的行为体征变化

既往曾有文献报道[12，13]，酒依赖大鼠的戒断症状在停酒后的24 h 内最严重，故本研究分别在实验组停酒后的6 h、18 h 进行戒断症状的评分。本研究采用改良后的评分标准进行评估，将每只大鼠放置于单独安静的场地中，每只评估时间不少于5 min。结果显示，大鼠在停酒后6 h 时戒断症状表现极为严重，戒断行为体征明显，如情绪燥闹，易激惹，对外界刺激具有攻击性，以及大部分大鼠听源性癫痫发作持续时间大于90 s，而其中一只大鼠更是因癫痫发作导致死亡。至戒断18 h 时，大鼠戒断体征虽有缓解，但仍存在较为严重的听源性癫痫发作。同时，实验组的戒断评分与对照组相比存在差异，说明了此方法建立酒精依赖大鼠模型是可靠的。

3.3 OXA 水平结果分析

研究表明，OXA 的水平浓度与酒精摄入量呈正相关，通过测定接受住院的AUD 患者外周血液中的OXA 浓度发现，相对于健康被试来说，患者的血液OXA 浓度水平有明显增高，同时纳入研究中的重度酒精依赖患者的血液OXA 浓度也高于中轻度成瘾的个体[14]。本研究结果显示，长期饮酒的大鼠体内拥有较高的OXA 水平，尤其是在停酒后6 h 大鼠血浆OXA 浓度水平与对照组存在差异。而随着戒断时间至18 h 左右，实验组OXA 水平虽与对照组无统计学差异，但总体水平仍高于对照组。此结果说明，随着戒断时间延长，OXA 水平呈下降趋势，这与国外动物实验中观察结果相一致[15，16]。于是可以提出猜测，长期的酒精摄入可能促进了食欲素mRNA 的表达，而高水平的OXA 因其在饮食方面的作用，又反过来促进酒精消耗，从而形成一种正反馈循环。总之，长期酒精在某种程度上促进了食欲素水平的上升。

3.4 OXA 与戒断症状的关系

目前，临床上对于AWS 的治疗主要是通过苯二氮 类药物（benzodiazepines，BZD）的替代治疗，虽然也有人曾尝试其他药物治疗AWS，如抗精神病药物、抗惊厥药及抗抑郁药物等，但效果均不及BZD 明显。本研究将实验组的OXA 水平与戒断评分进行相关性分析，结果表明二者之间存在正相关性。既往有研究表明[8，14]，酒精依赖男性患者戒断症状重度的个体比起症状中度的个体有着更高的血液Orexin 水平，据此可以提出大胆推测，在酒依赖患者血中OXA 水平越高，戒断症状可能就越严重，而通过应用Orexin 受体拮抗剂可能会减轻停酒后引起的戒断体征，这仍需要进一步实验来验证。

本研究亦存在部分不足之处：首先，大鼠模型样本量较少，可能对结果造成一定的局限性；其次，血浆中OXA 浓度水平含量较低，测定结果可能会有偏倚，较好的方法是采集大鼠脑脊液测定，但存在一定的技术困难；另外，腹主动脉采血法虽然简便易行，但也同时令大鼠迅速失血死亡，进而导致本研究缺乏对同一大鼠的动态性评估。因此，未来仍需规划更加严谨科学的方案进一步对本研究进行补充。

综上所述，Orexin 系统可能在急性酒精戒断反应中发挥重要作用，并可能是治疗AWS 的潜在靶点。对于将来该方面的研究，可以考虑在大鼠戒断时期利用Orexin 受体拮抗剂，观察在阻断食欲素受体作用后能否明显缓解AWS 症状，从而进一步探讨OXA 与AWS 症状的关系。