基于VIGS 技术干扰病毒RNA 防控烟草黄瓜花叶病毒病

2023-07-17郭玉鸽张倩杨惠娟李俊营常栋张富生武兆云阎海涛杨铁钊

山东农业科学 2023年6期

郭玉鸽，张倩，杨惠娟，李俊营，常栋，张富生，武兆云，阎海涛，杨铁钊

(1. 河南农业大学烟草学院，河南郑州 450002；2. 河南省烟草公司平顶山市公司，河南平顶山 467000)

由黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)引起的花叶病是烟草上的重要病害，严重影响烟叶质量[1，2]。黄瓜花叶病毒是雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)黄瓜花叶病毒属(Cucumovirus)的典型成员，为三分体正义单链RNA 病毒[3]，编码5 种蛋白[4]。 RNA1 编码1a 复制酶蛋白[5]；RNA2 的5′端编码2a 复制酶蛋白，3′端编码2b 蛋白[6]。前人研究发现植物受CMV 侵染后的症状表现是由1a 和2a 复制酶蛋白共同决定的，二者具有协同作用[7]。 RNA3 的5′端编码胞间运动蛋白(MP)，3′端编码外壳蛋白(CP)，与病毒扩散、长距离运输和包被作用有关[8]。目前生产上防治烟草黄瓜花叶病毒病通常以化学防治为主，容易造成药剂残留和环境污染等问题[9，10]。培育抗病品种也是防治烟草黄瓜花叶病的有效方式之一[11]，但至今还没有从烟草上克隆出CMV 抗性基因[12]，育种工作进展缓慢，而生物防治技术已经逐渐成为病害防治的新方法[13]。

病毒诱导基因沉默(virus－induced gene silence，VIGS)是一种对植物进行反向遗传操作的技术[14]，是植物防御机制的表现[15]。农杆菌介导的VIGS 技术通过农杆菌将携带目的基因片段的病毒载体转移到植物细胞中[16]，介导靶向同源基因的mRNA 降解，引起目的基因沉默[17]。烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus， TRV)载体是使用最广泛的VIGS 载体，具有沉默效率高、持久性长、不会对宿主造成明显伤害等优点[18]。目前VIGS 技术多用于基因功能鉴定和抗病抗虫[19，20]研究上:如龚攀[21]构建的甜菜VIGS 体系验证了抗旱相关基因功能；刘天波等[22]沉默马铃薯Y 病毒脉坏死株系外壳蛋白基因有效防治马铃薯Y病毒病。有研究表明，CMV 在不同作物中起关键作用的基因是不同的[23]。因此本研究根据CMV基因组及其编码蛋白的组成特征，构建靶向相关基因片段的TRV 载体，比较烟株接种VIGS 载体后对CMV 的抗性，以期筛选适用于大田防治烟草黄瓜花叶病的最佳VIGS 体系。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2022 年4—5 月进行。参试烤烟品种为中烟100，由河南农业大学烟草学院育种实验室提供。 pTRV2 载体购自武汉淼灵生物科技有限公司，根癌农杆菌GV3101 感受态细胞购自上海唯地生物技术有限公司。 CMV 病毒叶片由河南农业大学烟草学院育种实验室提供。

1.2 试验方法

1.2.1 引物设计根据已测定的CMV(GenBank登录号:GCA＿000864745.1)序列，选取适合用来构建VIGS 载体的片段，使用Oligo 7 软件设计特异性引物，其序列如表1 所示。

表1 本研究使用的引物序列

1.2.2 VIGS 载体的构建利用TRIzol 法提取感染了CMV 病毒的烟叶总RNA，参照北京全式金生物技术有限公司TransScript One－Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix 说明书反转成cDNA。以获得的cDNA 为模板，按照表1 引物利用诺唯赞生物技术有限公司的P505 高保真酶进行PCR 扩增。扩增体系:2×Phanta Max Buffer 25 μL，dNTP Mix(10 mmol/L) 1 μL，Phanta Max Super－Fidelity DNA Polymerase 1 μL，上下游引物(10 μmol/L)各2 μL，cDNA(20 μmol/L)模版1 μL，ddH2O 补至50 μL。反应条件:95℃预变性3 min；95℃变性15 s，68℃退火15 s，72℃延伸30 s，35 个循环；72℃终延伸5 min，琼脂糖凝胶电泳检测后纯化回收目的片段。对pTRV2 空载体质粒进行EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切后获得线性化载体。将扩增产物与线性化载体进行连接，随后转化至大肠杆菌DH5α 感受态细胞。将测序正确的单克隆菌株扩繁并提取质粒保存。

1.2.3 重组表达载体转化参照上海唯地生物技术有限公司的农杆菌GV3101 感受态细胞的使用说明书，将重组表达载体pTRV2－CMV－1a、pTRV2－CMV－2a、pTRV2－CMV－MP 和pTRV2－CMV－CP 转化农杆菌GV3101 感受态细胞。将菌液均匀涂抹在LB(含有浓度为25 mg/mL 利福平和50 mg/mL 卡那霉素)固体培养基上，28℃下倒置培养48 h；挑取单菌落经PCR 扩增后，使用琼脂糖凝胶电泳检测验证后分别扩繁。

1.2.4 农杆菌转化烟草将pTRV1、pTRV2、pTRV2－CMV－1a、pTRV2－CMV－2a、pTRV2－CMVMP 和pTRV2－CMV－CP 分别接种到LB 液体培养基上，28℃、200 r/min 过夜培养后，调整浓度OD600值为0.8 ～1.0，用pTRV1 分别与pTRV2、pTRV2－CMV－1a、pTRV2－CMV－2a、pTRV2－CMV－MP和pTRV2－CMV－CP 等比混合，离心后弃上清液，将沉淀重悬于等体积的侵染缓冲液(50 mmol/L MgCl2、50 mmol/L MES、0.1 mmol/L 乙酰丁香酮)中。选取长势均匀一致的六叶一心烟苗，用1 mL注射器注射侵染液于烟株嫩叶背面，每株烟注射2 片叶，每片叶注射1 mL。

1.3 试验设计

共设置6 个处理，分别为CK:不注射烟株；空载:注射接种含pTRV2 的侵染液(空载体对照)；C1:注射接种含pTRV2－CMV－1a 的侵染液；C2:注射接种含pTRV2－CMV－2a 的侵染液；C3:注射接种含pTRV2－CMV－MP 的侵染液；C4:注射接种含pTRV2－CMV－CP 的侵染液。每个处理注射接种20 株烟，每株烟接种2 mL，接种载体后14 d各处理均用金刚砂摩擦接种CMV 病毒。

1.4 测定指标

1.4.1 VIGS 载体接种效果及基因沉默效果的测定在接种VIGS 载体后10 d，各处理随机选择两株烟，取新长出的叶片，充分消毒后提取RNA，按照表1 中TRV2 扩增引物进行RT－PCR 检测。在接种病毒后7、14、21 d 时，各处理分别选择3株烟，取心叶向下第二片叶，充分消毒后提取RNA，反转录成cDNA，以烟草26S rRNA 为内参基因，根据GenBank 发布的相关基因序列设计扩增引物(表2)。按照Quant qRT－PCR kit (SYBR Green，TIANGEN 公司)使用说明在StepOneTMReal－Time PCR 仪(Life technologies 公司)上进行qRT－PCR 检测。根据已得到的Ct 值，采用2－ΔΔCt法分析CMV 和TRV 基因的相对表达量。基因沉默效率(%)计算公式:(对照组CMV 累积量－处理组CMV 累积量)/对照组CMV 累积量×100。

表2 qRT－PCR 所用引物

1.4.2 病毒浓度的测定在接种病毒后30 d，各处理选择发病情况一致的3 株烟，取心叶向下第二片叶，液氮速冻后保存于冰箱，使用黄瓜花叶病毒(CMV)酶联免疫分析试剂盒(上海酶联生物科技有限公司)测定烟株内CMV 病毒浓度。

1.4.3 发病情况的测定在接种病毒后第7 天观察发病情况。根据《烟草病虫害分级及调查方法》(GB/T 23222—2008)以株为单位进行病级鉴定，根据下列公式计算发病率、病情指数和防治效果。

发病率(%)＝发病株数/调查总株数×100 ；

病情指数＝(Σ 各级病株数×病级代表值)/(调查总株数×最高病级代表值)×100 ；

防治效果(%)＝(对照病情指数－处理病情指数)/对照病情指数×100 。

1.5 数据分析

采用SPSS 16.0 软件对数据进行差异显著性分析(Duncan′s)，采用Microsoft Excel 2007 整理分析数据。

2 结果与分析

2.1 VIGS 载体构建

由图1 可知，PCR 扩增得到的基因片段大小与表1 一致。分别将这些基因片段同pTRV2 的线性化载体相连接，获得对应的表达载体，将测序正确的表达载体转化农杆菌GV3101 感受态细胞。

图1 目的基因的PCR 扩增

2.2 VIGS 载体接种效果

以TRV2－F/TRV2－R 为引物，进行RT－PCR检测(图2)，产物大小约为744 bp，说明VIGS 载体成功导入烟株。

图2 VIGS 载体接种烟株后的RT－PCR 检测

2.3 基因沉默效果分析

从图3 可以看出，空载体处理的CMV 相对表达量在接种病毒后7 d 和21 d 与对照相比有一定程度的降低。接种病毒7 d 后，C2 处理的CMV相对表达量最低，基因沉默效率最高，为46.25%；接种病毒14 d 后，空载体处理的病毒相对表达量较对照有一定程度的升高，C2 和C3 处理的病毒相对表达量均显著低于对照，基因沉默效率分别为39.38%和26.24%；接种病毒21 d 后，接种载体的处理CMV 相对表达量均显著低于对照和空载体处理，C2 处理基因沉默效率仍最高，为36.8%，C4 处理次之。

图3 接种病毒后CMV 相对表达量

从图4 可以看出，TRV 相对表达量不同处理间差异显著，C2 处理的TRV 表达量显著高于空载体处理，C4 次之，C1 最少。

图4 接种病毒后TRV 相对表达量

2.4 基因沉默后病毒浓度

接种病毒30 d 后，各处理CMV 浓度表现出与CMV 相对表达量相似的变化趋势，C2、C3、C4处理的CMV 浓度均显著低于对照和空载体处理。其中C2 处理的病毒浓度最低，仅为对照的72.8%；C4 次之，病毒浓度为对照的86.5%；C3 处理为对照的91.3%(图5)。

图5 接种病毒后30 d CMV 浓度变化

2.5 基因沉默后抗病效果分析

由表3 可知，发病初期C2 处理的发病率、病情指数最低，防治效果最好；C4 处理次之；空载体的发病情况略轻于对照。发病高峰期，除C2 处理发病率为95%外，其它处理的发病率均为100%，C2 的病情指数最低，防治效果最好。

表3 不同处理的发病情况

3 讨论

Waterhouse 等[24]将马铃薯Y 病毒蛋白酶基因片段转入烟草中，获得抗马铃薯Y 病毒的转基因烟草。程英豪等[25]将黄瓜花叶病毒(CMV)外壳蛋白转入烟草，获得的转基因烟草对CMV 抗性增强。目前烟草的大多数抗病毒研究都是通过将病毒的外壳蛋白基因导入烟草来提高抗性[26，27]，该过程会产生病毒蛋白，因此其安全性存在争议[28]。病毒诱导的基因沉默(VIGS)属于转录后水平的基因沉默(posttranscriptional gene silencing，PTGS)，利用植物固有的RNA 干扰和病毒免疫应答机制[29]，避免了翻译为蛋白的安全性问题。目前VIGS 技术已成功应用到病虫害防治中，也被称为寄主诱导的基因沉默(host－induced gene silencing，HIGS)。 Nowara 等[30]首次发现，将病原体基因导入病毒载体并感染寄主植物后，寄主植物细胞中会产生dsRNA，并在病原体感染寄主时进入病原体中，从而引发病原体发生PTGS。前人将线虫基因片段导入TRV 载体后侵染拟南芥，成功抑制了根部寄生线虫体内目标基因的表达[31]。

基因沉默的关键是找到起关键作用的靶标基因。 CMV 的1a 和2a 蛋白共同组成RNA 聚合酶，并与寄主因子结合形成复合物，在病毒的复制中起作用[32]。位于胞间连丝的胞间运动蛋白(MP)参与了CMV 的胞间运转和系统运转[33]。外壳蛋白(CP)是一个多功能蛋白，其主要功能是组装病毒，此外该蛋白还是关键的致病因子，参与复制、翻译、运动、蚜传等多个过程[34]。由于CMV 在不同作物中起关键作用的基因不同，因此本研究分别在CMV 的4 个关键蛋白上构建VIGS 载体。

本研究建立的VIGS 体系中CMV－2a(C2)的基因沉默效果最好，接种病毒后7 d 基因沉默效率最高，病毒累积量最低。这与前人的研究结果相似:将CMV 的2a 基因转化入烟草，获得的烟草植株发病率降低，发病时间推迟[35]。此外，空载体处理的CMV 累积量与对照相比也有所下降，接种病毒后21 d 达到显著性差异。前人研究认为病毒是植物的应激因素，推测接种空载体后引起了植物一系列的防御反应[36]，抑制了CMV 病毒在烟株内的传播。接种病毒30 d 后，C2 处理的CMV 病毒浓度最低，即CMV－2a VIGS 载体对CMV 的抑制作用最好，且TRV 载体的含量在各处理中最高。 C2 处理发病初期的发病率最低，仅为对照的40%，发病时间推迟，有效抑制了CMV在烟株内的传播。

通过VIGS 技术沉默CMV－2a 基因可以很好地防治烟草黄瓜花叶病，下一步将进行大规模田间试验，为后期大田应用提供理论基础。 VIGS 技术具有成本低、方法操作简单等优点[37]，并且对植物无伤害，对环境无污染，是一种具有较好应用前景的方法。然而温度是限制VIGS 技术应用的主要因素[38]，因此开发出耐高温的载体是VIGS技术未来需要努力的重点和方向。