黄瓜肌醇半乳糖苷合成酶基因GolS2 克隆与表达调控

袁晓，杨盼迪，朱云娜，王玉昆，王斌

(韶关学院生物与农业学院/广东省粤北食药资源利用与保护重点实验室，广东韶关 512005)

非生物胁迫如干旱、重金属、高低温、盐渍、水浸等会对植物的生长发育和地理分布、作物产量和品质等造成严重影响[1，2]。 随着全球气候变暖，各种极端天气频繁发生，加剧了非生物胁迫对农作物生产的影响[3]。 与动物可随时移动不同，植物一旦在特定介质上固着，便不能自主移动[4]，因此，植物与动物应对非生物胁迫的方式有着很大不同，植物必须依靠自身的防御系统抵抗或适应非生物胁迫。 植物适应非生物胁迫的途径主要包括:激活自身的抗氧化防御系统，诱导抗逆相关基因转录和蛋白积累，促进渗透物质的积累以保持细胞内外渗透平衡[5]。

在遇到非生物胁迫时，植物细胞内可溶性糖等渗透性物质的合成积累，被认为是植物增强非生物胁迫抗性的重要方式[6]。 增加细胞内渗透性物质的含量，能提高细胞渗透势，增强植物对逆境胁迫的耐受性[7]。 棉子糖系列寡糖(raffinose family oligosaccharides， RFOs)是重要的渗透调节物质[8]，同时也是葫芦科植物同化物的主要运输形式[9]。 因此，RFOs 在葫芦科植物中具有双重作用，既起到渗透调节的作用，还负责同化物的运输。 肌醇半乳糖苷合成酶(galactinol synthase，GolS)是催化RFOs 合成第一步反应的关键调节酶，直接催化肌醇和UDP-半乳糖形成肌醇半乳糖苷[6]。 因此，GolS 在调控RFOs 合成和增强葫芦科植物抗逆性中具有重要作用。

黄瓜(Cucumis sativus)是葫芦科黄瓜属一年生攀援性草本植物，喜温，是我国重要的经济作物[10，11]。 黄瓜对高低温、盐碱等非生物胁迫的耐受能力较差，盐胁迫和高低温胁迫严重影响其生长发育，甚至降低采后黄瓜的品质和耐贮性，往往导致严重的经济损失[12，13]。 据报道，黄瓜基因组中共含有4 个GolS基因，它们在多种非生物胁迫处理后在黄瓜叶片中显著上调表达，其中GolS1表达上调能在低温胁迫条件下促进同化物在韧皮部的装载，提高叶片光合作用效率，促进RFOs 积累[9]。 低温和干旱胁迫处理诱导黄瓜GolS4基因在叶片中的表达，过表达GolS4基因提高RFOs 含量，降低活性氧(reactive oxygen species， ROS)含量；相反，沉默GolS4基因表达的转基因黄瓜在干旱胁迫处理后更容易萎蔫[14]。 这些研究结果表明，GolS基因在黄瓜抵抗低温和干旱等非生物胁迫过程中具有重要作用。 采后黄瓜属于离体器官，黄瓜GolS基因的功能在离体器官和非离体器官中是否保守，目前仍不清楚。

本研究从黄瓜中克隆了GolS2基因，分析了其氨基酸序列特性及与其他植物GolS2 的序列差异，并研究了GolS2基因在黄瓜幼苗和采后黄瓜中响应非生物胁迫的差异，以期为揭示黄瓜GolS2基因的生物学功能奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料和试验处理

所用黄瓜品种为“翠夏”和“津春2 号”，克隆载体为pMD18－T，VIGS 实验载体为pTRV1 和pTRV2，均由本实验室自行扩繁保存。 大肠杆菌DH5α 感受态细胞购自上海唯地生物有限公司，高保真PCRTaq酶和植物总RNA 提取试剂盒由北京天根生化科技有限公司提供，cDNA 合成试剂盒购自上海翌圣生物科技股份有限公司。

于2020 年5 月在本地黄瓜种植基地采收即将上市的黄瓜果实，室温条件下一小时内运回实验室。 挑选成熟度基本一致、大小均一的黄瓜果实作为试验材料。 将挑选好的采后黄瓜分成两组，每组含有3 个独立的生物学重复，每个生物学重复含有10 根黄瓜。 采后黄瓜装框，并用塑料薄膜保鲜袋密封包装，分别在5℃和10℃贮藏库(相对湿度95%～98%)中贮藏72 h。

1.2 试验方法

1.2.1 黄瓜GolS2基因全长克隆 在黄瓜基因组数据库(http:/ /www.cucurbitgenomics.org/)中检索GolS2(登录号:CsaV3＿1G015730)基因，并根据mRNA 序列设计特异引物。 引物由生工生物工程(上海)有限公司广州分公司合成，序列如表1 所示。 使用植物RNA 提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)提取黄瓜总RNA，运用反转录试剂盒(上海翊圣生物科技有限公司)合成cDNA。以cDNA 为模板，采用RT－PCR 扩增黄瓜GolS2全长序列。 PCR 反应程序:94℃预变性5 min；94℃变性35 s，58℃退火35 s，72℃延伸5 min，35个循环；最后72℃延伸10 min。 PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳确认长度后，回收并连接到pMD18－T(日本Takara 公司) 载体上，并转化DH5α 感受态细胞。 挑取阳性单菌落扩繁，并送至生工生物工程(上海)有限公司广州分公司测序鉴定。

表1 引物信息

1.2.2 生物信息学分析 在ExPASy 平台完成黄瓜GolS2 蛋白理化性质分析，利用Cell－PLoc 2.0在线预测蛋白的亚细胞定位。 在黄瓜基因组中调出GolS2翻译起始密码子ATG 上游1 500 bp 长度的DNA 序列，提交PlantCARE 分析其启动子中的顺式作用元件，并用TBtools 软件绘制作用元件在启动子中的定位[15]。 在NCBI 数据库中同源比较，挑选出同源性较高的同源蛋白。 使用DNAMAN 软件比对氨基酸序列，并用MEGA 软件(Neighbor－Joining 法)构建系统进化树。 本研究用到的生物信息学分析软件或在线工具见表2。

表2 本研究用到的生物信息学分析工具

1.2.3 采后黄瓜VIGS 沉默实验 黄瓜HHO2(hypersensitive to low Pi － elicited primary root shortening homologue 2)是一个MYB like 转录因子，GRP3(glycine－rich RNA－binding protein 3)是一个RNA 结合蛋白，他们对低温应答基因的表达具有调节作用[16－19]。 为研究两基因对黄瓜GolS2基因表达的调节作用，对采后黄瓜进行VIGS 沉默实验。

在HHO2和GRP3基因全长序列的3′端附近设计引物，并在上、下游引物序列的5′端加入BamH Ⅰ酶切位点序列，引物信息见表1。 以cDNA 为模板，使用高保真PCRTaq酶扩增目的片段。 目的片段经酶切和凝胶电泳分离后，与pTRV2 质粒相连接。 重组质粒转化DH5α 感受态细胞，经测序鉴定后，提取重组质粒并转化农杆菌感受态GV3101 细胞。

将含有pTRV1 空载的农杆菌分别与含pTRV2－HHO2 和pTRV2－GRP3 重组质粒的农杆菌单独或同时等体积混匀，室温静置2 h。 使用医用注射器，将农杆菌分别注射在黄瓜果实的三个部位(远离果蒂5 cm、远离果柄5 cm、果柄和果蒂之间的最中间部位)。 然后将果实装在果篮中，用聚乙烯塑料薄膜袋包装果篮。 室温(25℃)暗培养48 h，使农杆菌恢复活性，充分沉默目的基因。 将整个果篮转移至5℃冷库贮藏72 h，检测沉默HHO2和GRP3基因对采后黄瓜GolS2基因表达的影响。

1.2.4 基因的表达分析 由北京百迈客生物科技有限公司完成处理样品的总RNA 提取和测序建库，并利用Illumina next seq 2500 测序平台完成转录组测序工作，测序流程和数据处理方法见参考文献[20]。 用FPKM(fragments per kilobase per million mapped reads) 值表示GolS2的表达水平。

1.3 数据分析

在Mircrosoft Excel 2016 软件中整理数据，利用SPSS 22.0 软件分析数据之间的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 黄瓜GolS2 基因克隆及结构分析

如图1A 所示，从黄瓜中克隆出了一条约1 000 bp的DNA 片段，总体与黄瓜GolS2基因长度(981 bp)一致。 将该DNA 片段与pMD18－T 载体相连接，转化DH5α 感受态细胞扩繁，经测序验证，目的产物正是CsGolS2基因。 该基因定位在1号染色体，ORF 由4 个不同长度的外显子构成(图1B)，第一个外显子最长(406 bp)，第三个外显子长度只有135 bp。

图1 黄瓜果实GolS2 全长PCR 电泳图(A)及其在染色体上的定位(B)

2.2 CsGolS2 基本特征分析

CsGolS2基因ORF 全长981 bp，编码326 个氨基酸(图2)。 理论分子量为37.83 kDa，等电点为5.51。 氨基酸中带负电荷的残基总数为42 个，带正电荷的残基总数为32 个。 编码蛋白质的不稳定系数为41.45，属于不稳定蛋白，脂肪族指数为78.31，平均疏水指数为－0.34。

图2 黄瓜CsGolS2 开放阅读框序列及推导的氨基酸序列

CsGolS2 蛋白的氨基酸序列中含有5 个保守的丝氨酸磷酸化位点，在C 端还含有1 个疏水性APSAA 五肽结构(图2)，这些是植物GolS 蛋白的典型特征[21]。 亚细胞定位预测结果显示，Cs-GolS2 蛋白可能定位在细胞壁、叶绿体、细胞质和线粒体等亚细胞器中。

2.3 多序列比对与进化分析

CsGolS2 与葫芦科其他4 种植物GolS2 的氨基酸序列一致性很好(图3)，表明葫芦科植物GolS2 蛋白保守性很高，推测葫芦科植物GolS2 蛋白的生物学功能可能保守。 其中，CsGolS2 与甜瓜(Cucumis melo)CmeGolS2 蛋白(XP＿008463593.1)的序列一致性最好。

图3 5 种葫芦科植物GolS2 蛋白的氨基酸多序列比对

CsGolS2 与其他8 种植物GolS2 蛋白的同源性分析结果如表3 所示，可见CsGolS2 与其他8种植物GolS2 蛋白的氨基酸序列同源性介于73.06%～97.85%之间，与甜瓜GolS2 的同源性最高，为97.85%。 说明植物GolS2 在进化过程中高度保守，暗示着它们具有相似的生物学功能。

表3 不同植物GolS2 蛋白同源性比较 (%)

比较了CsGolS2 蛋白与4 种模式植物GolS2蛋白的氨基酸序列相似性和结构域保守性，结果(图4)显示，尽管5 种植物GolS2 蛋白的氨基酸序列长度有所不同，但序列中均含有一个糖基转移酶保守结构域，属于糖基转移酶超级家族；且保守结构域的氨基酸序列一致性很高，表明保守结构域的保守性很高。

图4 黄瓜与4 种模式植物GolS2 蛋白的氨基酸序列比对

在拟南芥(Arabidopsis thaliana)基因组数据中共鉴定出了9 个GolS基因，分别命名为At-GolS1～AtGolS9。 拟南芥通常被作为研究候选基因功能的模式植物，相关基因的功能已研究的比较清楚，因此，比较了CsGolS2 蛋白与拟南芥GolS家族蛋白的进化关系(图5)，以期在一定程度上推测CsGolS2 蛋白的生物学功能。 可以看出，拟南芥GolS 家族蛋白可分为两组，AtGolS8 和At-GolS9 聚在一组，黄瓜GolS2 与其他7 个拟南芥GolS 蛋白聚在另一分支，CsGolS2 与AtGolS2 和AtGoLS3 的亲缘关系最近。

图5 黄瓜GolS2 蛋白与拟南芥GolS 家族的亲缘关系

2.4 基于文献的盐胁迫和低温胁迫对黄瓜幼苗GolS2 基因表达的影响

前人利用转录组测序分析了黄瓜基因组中所有基因的表达水平，我们从中挑选了黄瓜幼苗GolS2基因在盐胁迫和低温胁迫后的表达数据[22]，结果(图6)显示，盐胁迫显著上调GolS2基因在黄瓜幼苗中的表达，表达量比对照(CK)高42.10 倍；低温处理显著诱导GolS2基因表达，处理6 h 和12 h 的表达量显著高于处理2 h。 表明黄瓜GolS2是一个抗逆性相关基因，其表达可能与黄瓜幼苗对盐胁迫和低温胁迫的应答密切相关。

图6 盐胁迫(A)和低温胁迫(B)处理对黄瓜幼苗GolS2 表达的影响

2.5 黄瓜GolS2 基因启动子分析

由于盐胁迫和低温胁迫显著上调GolS2基因在黄瓜幼苗中的表达，推测该基因启动子中可能含有逆境响应元件。 因此，从基因组数据中调出位于起始密码子上游1 625 bp 长度的DNA 序列，分析启动子中的瞬时作用元件，结果(图7)显示，CsGolS2基因启动子中含有丰富的逆境胁迫响应相关元件。 其中，有2 个元件与昼夜节律(circadian)调节相关，有9 个光响应元件(4 个G－Box、2 个Box 4、1 个TCT－motif、1 个LAMP－element、1个chs－CMA1a)，3 个厌氧诱导元件ARE，2 个茉莉酸甲酯响应元件(TGACG－motif 和CGTCA－motif)，6 个乙烯响应元件(4 个ERE 和2 个Wbox)，3 个ABA 响应元件ABRE。 这些结果再次证明黄瓜GolS2是一个典型的逆境胁迫相关基因。 此外，启动子中还鉴定出多个转录因子结合位点，比如8 个MYB 转录因子结合位点，3 个MYC 结合位点，表明黄瓜GolS2基因的表达可能受到MYB 和MYC 类转录因子的调控。

图7 黄瓜GolS2 启动子中与逆境相关的顺式作用元件分析

2.6 低温处理对采后黄瓜GolS2 基因表达的影响

与黄瓜幼苗不同的是，采后黄瓜由于脱离了母体，没有营养供应来源，只能通过呼吸代谢维持生命活动[7，16]。 在响应低温胁迫过程中，GolS2在采后黄瓜和黄瓜幼苗中的表达模式是否一致，目前未见相关报道。 鉴定能同时提高植株和采后果实耐冷性的功能基因，对于培育耐冷黄瓜新品种具有重要意义。 为此，本研究分析了GolS2在采后黄瓜中响应低温处理的表达模式，结果(图8)显示，与幼苗中的表达模式不同，GolS2表达水平在5℃和10℃低温处理后显著下降，且处理时间越长，下降越明显；10℃低温处理对GolS2表达的抑制作用强于5℃低温处理。 表明低温处理抑制采后黄瓜GolS2表达，可能负调控采后黄瓜耐冷反应。

图8 低温处理对采后黄瓜果实GolS2 表达的影响

2.7 沉默GRP3 和HHO2 基因对采后黄瓜GolS2基因表达的影响

为研究HHO2和GRP3是否对GolS2基因表达具有调节作用，分析了沉默GRP3和HHO2基因对采后黄瓜GolS2表达的影响，结果(图9)显示，不论单独沉默GRP3或HHO2基因，还是同时沉默GRP3和HHO2基因，均显著下调GolS2表达，表明GRP3 和HHO2 蛋白可能调控GolS2表达。

图9 GRP3 和HHO2 沉默对采后黄瓜GolS2 表达的影响

3 讨论与结论

肌醇半乳糖苷合成酶是调节棉子糖系列寡糖合成的关键酶，对细胞渗透调节具有重要作用[23]。 因此，克隆黄瓜GolS家族基因，并分析其响应非生物胁迫的表达模式，有助于丰富和完善植物GolS家族基因的功能。 本研究从黄瓜中克隆了GolS2基因，其编码326 个氨基酸残基。 序列分析结果显示，黄瓜GolS2 与拟南芥GolS 家族蛋白的亲缘关系较近，与其他植物GolS 蛋白的同源性也很高，序列中均含有一个糖基转移酶保守结构域。 同时，黄瓜GolS2 蛋白氨基酸序列具有植物GolS 蛋白的典型特征，比如在氨基酸序列C端含有保守的疏水性APSAA 五肽结构。 这些结果证实，黄瓜GolS2 属于植物GolS 大家族。

植物GolS家族基因的表达受多种非生物胁迫因子诱导，表达上调可促进RFOs 积累和增强抗逆性。 在大豆[Glycine max(L.) Merr.]幼苗中，包括高低温、干旱及高盐等在内的多种非生物胁迫可不同程度地诱导GmGolS1基因表达，且高温胁迫对GmGolS1基因表达的诱导作用最强烈[24]。 干旱和高盐胁迫显著诱导AtGolS1和At-GolS2基因的表达，而AtGolS3基因表达受低温胁迫诱导，超表达AtGolS2基因的转基因拟南芥抗旱性显著提高[25]。 干旱胁迫诱导芝麻(Sesamum indicumL.)SmGolS6基因的表达，在拟南芥中异源超表达该基因，提高了转基因拟南芥的抗旱性[26]。 盐胁迫和低温胁迫处理显著诱导黄瓜幼苗GolS2基因表达，且该基因启动子中含有丰富的逆境胁迫响应元件，表明黄瓜GolS2是一个逆境响应基因，其表达上调可能是黄瓜幼苗适应非生物胁迫的重要机制。

尽管植物GolS 蛋白的功能在进化中保守性较好，但同一基因在不同类型器官中的功能是否存在明显差异，目前仍不明确。 在黄瓜幼苗中，干旱和低温胁迫处理显著诱导GolS2基因的表达；但在离体的采后黄瓜中，低温处理却显著下调GolS2基因的表达，且10℃处理比5℃处理的抑制更强。 此外，黄瓜GolS2基因启动子中含有丰富的光响应元件。 这些结果表明，黄瓜GolS2基因的生物学功能可能在不同类型器官中存在较大差异，非生物胁迫对黄瓜GolS2基因表达的诱导作用可能依赖于光照；也意味着在采后黄瓜中增强GolS2基因表达，或许并不能增强采后黄瓜的耐冷性，若需要通过转基因的方法提高采后黄瓜耐冷性，GolS2基因可能不是一个有效的候选基因。叶片是植物进行光合作用的主要器官，黄瓜GolS1和GolS4基因在叶片中表达上调，能提高叶片的光合作用效率，促进RFOs 的积累[9，14]。 而果实是养分贮藏器官和生殖器官，采收后一般贮藏在密闭或黑暗空间中[27]，采后黄瓜在贮藏过程中很难进行光合作用，尽管黄瓜果实中也含有叶绿体[20]，表明黄瓜GolS2促进RFOs 积累与同化物转运效率的提高有关。

植物GolS家族基因的表达还受转录调节因子的调控。 旋蒴苣苔(Boea hygrometrica)WRKY1转录因子可直接与BhGolS1基因启动子中的Wbox 元件结合，调控其表达[28]。 葡萄(Vitis viniferaL.)AQUILO 是一个MYB like 转录因子，其通过调节VvGolS家族基因的表达促进RFOs 合成和积累[29]。 本研究中，黄瓜GolS2基因启动子中发现了多个MYB 和MYC 转录因子的结合位点，沉默HHO2基因显著下调采后黄瓜GolS2表达，表明HHO2 可能是直接调控GolS2基因表达的MYB转录因子。 HHO2 是否直接调控GolS2表达，以及具体的调控机制是怎样的，尚需更多研究进一步探明。 植物GRP 蛋白具有类似分子伴侣的功能，对mRNA 的稳定性调节具有重要作用[30]。 本研究中，沉默GRP3显著抑制采后黄瓜GolS2基因表达，表明GRP3 蛋白可能同时在转录和转录后水平上调控GolS2基因表达。

总之，本研究从黄瓜中克隆了GolS2基因，其属于植物GolS基因超级家族。GolS2是一个逆境应答相关基因，高盐和低温处理诱导GolS2基因在黄瓜幼苗和叶片中的表达，但低温处理却下调其在采后黄瓜中的表达，表明其可能通过提高黄瓜光合效率和同化物转运效率促进RFOs 积累。由于采后黄瓜在贮藏期间很难进行光合作用，若利用分子育种方法培育果实耐冷性强的转基因黄瓜，GolS2可能不是一个有效的目标基因。