芦笋腋芽一步成苗组培技术研究

卢金东，王波，厉广辉，周长生，尹俊玉，王兴军，赵术珍

(1. 山东省农业科学院农作物种质资源研究所/山东省作物遗传改良与生态生理重点实验室，山东济南 250100；2. 潍坊工程职业学院，山东青州 262500；3. 山东巨鑫源农业科技有限公司，山东曹县 274400；4. 北京市农林科学院，北京 100081)

芦笋(Asparagus officinalisL.)属于百合科天门冬属植物，也称石刁柏，是一种宿根性的多年生草本植物，属于典型的雌雄异株植物[1]。 芦笋富含蛋白质、维生素、多糖、黄酮类、皂苷等多种活性成分，具有抗氧化、抗肿瘤、提高免疫力等功效，是一种食药兼用型蔬菜，被誉为“蔬菜之王”。 据FAOSTAT(Food and Agriculture Organization Corporate Statistical Database)统计，2014—2020 年我国及全球芦笋种植面积及产量均呈逐年增长态势，2020 年我国芦笋种植面积为9 万公顷，约占世界种植面积的35%，是芦笋生产第一大国[2]。芦笋种子大部分依赖进口，由于价格高，利润空间大，国内市场上假种子屡禁不止，导致我国芦笋与美国、西班牙等国家的相比，单产低、质量差，国际市场竞争力较弱[3]。 因此，加快国内优异品种培育是提高芦笋国际市场竞争力的关键所在。 芦笋生产用种为F1杂种，但因芦笋为雌雄异株植物，无法通过自交保持和繁育优良品系，其雌雄亲本的繁殖只能通过营养繁殖，因此，亲本材料的组培快繁就成为芦笋杂交育种的关键环节。 建立高效的离体繁殖技术，既可有效保持优良品种的种性，防止品种在繁育过程中混杂退化，又可实现优异杂交亲本的工厂化育苗，加快芦笋良种生产，实现芦笋品种国产化，对推动我国芦笋产业的发展具有重要意义。

关于芦笋再生体系的研究已有不少报道，多是通过两种途径获得再生植株，一是以茎尖[4，5]、种子[6]、嫩茎[7]等为外植体，先形成愈伤组织，再诱导胚状体或不定芽，最终获得再生植株；二是不经过愈伤组织诱导过程，利用嫩茎[8－10]、茎段[11]、茎尖[12－14]等材料，直接使顶芽或腋芽增殖形成丛生芽，然后生根获得再生植株。 但经过愈伤组织诱导的再生途径存在体细胞变异现象，不是优良材料或亲本繁殖的最佳途径；而不经愈伤组织诱导的途径也需先进行芽诱导、芽增殖和生根等多步培养，比较繁琐。 基于此，本研究通过外植体及其消毒方法、生根培养基中激素组合的筛选试验，建立了由芦笋腋芽一步诱导再生植株的离体培养体系，能够简便、快速、高效地实现芦笋无性繁殖，为其工厂化育苗提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试芦笋材料为全雄种质Y14。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体及灭菌方法筛选 从田间取回幼茎，先用自来水流水冲洗5 min，然后用中性洗涤液逐条清洗，注意不要损伤顶芽和侧芽，再用自来水流水冲洗15 min；截取3 ～5 cm 笋尖和5 ～10 mm 腋芽分别进行消毒处理，先用75%乙醇浸泡30 s，然后按表1 设计在160 r/min 摇床上不断摇动消毒；取出外植体用无菌水冲洗5 次，每次3 min，用无菌滤纸吸干多余水分，接种于不同的生根培养基中，每种消毒方法接种10 瓶，每瓶接种4 个外植体，然后置于培养室中培养，培养条件为27℃、每天光照14 h、光照强度3 000 lx。 培养10天后，统计不同处理的污染率，以确定适宜的灭菌方法。 外植体污染率(%)＝污染外植体个数/接种外植体总数×100。

1.2.2 生根培养基筛选 基础培养基为1/2MS＋2%蔗糖＋0.65%琼脂，pH5.6 ～5.8，选用NAA、KT、IBA、PP333和嘧啶醇，设计5 种激素组合处理，配制5 种生根培养基，具体见表2。 将消毒后的腋芽接种于各生根培养基上，在27℃、每天光照14 h、光照强度3 000 lx 下进行生根培养，70 天后统计根生长情况。

表2 不同生根培养基激素处理组合

1.3 数据处理与分析

运用Microsoft Excel 2003 进行数据处理，并用SPSS 21.0 软件进行单因素方差分析(one－way ANOVA)，用最小显著差异法(LSD 法)进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 外植体及其适宜灭菌处理的确定

外植体消毒是组织培养的一个非常重要环节，有效消毒方法的建立是保证组织培养成功的第一步。 考虑到外植体对污染率的影响，本试验分别选用5～10 mm 腋芽(图1A)和3～5 cm 笋尖(图1B)两种外植体，用不同灭菌剂进行消毒。 结果(表3)显示，相同外植体和灭菌剂处理下，外植体污染率随着灭菌时间的延长而下降，处理20 min 时最低，均在10.0%及以下；在相同灭菌剂处理下，以芦笋腋芽为外植体的污染率明显低于以笋尖为外植体的，降幅在5.0 ～10.0 个百分点，污染率为5.0%～15.0%；两种灭菌剂间比较，相同外植体、处理相同时间条件下，0.1%升汞处理的污染率更低，可降低2.5～5.0 个百分点。 此外，在试验中还观察到，笋尖鳞片(变态叶)包裹的紧实程度也是影响污染率的重要因素，包裹越紧实，污染率越低。 综合上述分析，确定本试验的最佳灭菌体系为:选取鳞片包裹紧实的笋尖，自来水流水冲洗5 min 后用中性洗涤液逐条清洗，再用自来水流水冲洗15 min，剥去鳞片，取腋芽用75%乙醇浸泡30 s，无菌水冲洗2 次，然后用0.1%升汞浸泡20 min，期间置于160 r/min 摇床上摇动，然后取出用无菌水冲洗5 次，每次3 min。

图1 外植体材料的选取部位

表3 不同灭菌剂对不同芦笋外植体的消毒效果比较

2.2 适宜生根的激素组合筛选

将消毒好的腋芽分别转接到含有不同激素的生根培养基上，培养30 天开始生根，培养至70 天时对生根率及生根类型进行调查统计。 结果(图2、表4)发现，再生根可明显分为3 种类型，分别为从腋芽基部直接生出的粗壮肉质根(Ⅰ型)、从腋芽基部的愈伤组织上产生的不定根(Ⅱ型)以及从腋芽基部直接生出的细长根(Ⅲ型)。 3 种根型在不同生根培养基上的发生比例不同，在RM5培养基上产生的根质量较好，主要是Ⅰ型根，有少量Ⅱ、Ⅲ型根，生根率最高，达92.00%；在RM1 和RM4 上产生的主要是Ⅰ型和Ⅲ型根，有少量Ⅱ型根，生根率也较高，分别为87.50%和80.67%，与RM5 差异不显著；在RM2 培养基上，生根率显著降低，为68.43%，产生的根主要是Ⅲ型和Ⅱ型，仅有少量Ⅰ型根；在RM3 培养基上，虽然形成的根也主要是Ⅰ型和Ⅱ型，Ⅲ型很少，但生根率很低，仅为38.89%，显著低于其它处理。 可见，NAA 浓度为0.05 mg/L 时更有利于芦笋腋芽生根，且根的质量更好；相比于0.02 mg/L，KT 浓度为0.1 mg/L 时更有利于生根；嘧啶醇的生根效果优于PP333。 综合上述分析，确定适宜的生根培养基为RM5，即1/2MS＋0.05 mg/L NAA＋0.1 mg/L KT＋1.0 mg/L 嘧啶醇＋1.0 mg/L IBA＋2%蔗糖＋0.65%琼脂，在此条件下可产生较多粗壮的Ⅰ型根，而具有Ⅰ型根的植株在培养45 天后，芽开始迅速伸长生长，培养至60 天左右芽长可达3～5 cm。

图2 芦笋组培过程中3 种生根类型

表4 不同激素组合对芦笋生根的影响

2.3 芦笋再生植株的炼苗及移栽

生根培养70 天左右，将培养瓶盖打开并半覆盖在瓶口，置于培养室弱光条件下放置2 天，然后将生根苗从瓶中取出，用自来水小心冲洗掉芦笋根上的培养基后，移至盛有潮湿营养土的塑料盆中，在27℃、每天光照14 h、光照强度3 000 lx 条件下继续培养；移栽第1 周是再生植株能否成活的关键期，需要确保较高的土壤湿度和空气湿度，因此用保鲜膜覆盖以保持湿度；进入第2 周，可将保鲜膜部分掀起，进行适度透气；随着培养时间的延长，根据小苗的生长状态，透气程度逐步提高，直到完全去掉保鲜膜；待植株长出3 ～4 个分枝时即可移植到大田，此时的苗已经长出很好的根系(图3)，移栽成活率可达98%以上。 幼苗在大田中生长旺盛，1 个月左右即可长成健康植株。

图3 可移植到大田的幼苗地上部分(A)及根系(B)生长情况

3 讨论与结论

在组织培养中，芦笋试管苗诱导生根时会产生不同类型的根，Ⅰ型根是从茎上发生的，与茎部维管束相通，较粗壮，具有这类根的再生苗移栽成活率在98%以上；Ⅱ型根是从愈伤组织上发生的不定根，这些根与茎部的维管束没有直接连接，只具有这类根的再生苗，移栽后很难成活；Ⅲ型根也是从茎基部发生的，但较细弱，只具有这类根的再生苗，移栽也不容易成活[15]。 在芦笋的组织培养过程中，芽增殖和伸长较容易，但生根困难，这一直是芦笋组织培养的瓶颈。 这不仅表现在有些品种难以生根或生根率低，也表现在生根中Ⅱ型和Ⅲ型根较多[16－20]。

嘧啶醇能够抑制赤霉素合成关键酶如古巴焦磷酸合成酶、内根－贝壳杉稀合酶等的活性，降低植物体内的赤霉素水平。 嘧啶醇对芦笋生根有明显的促进作用，可能是其通过减少芦笋体内的赤霉素含量而促进了根的形成[21，22]。 但是嘧啶醇价格昂贵，因此本试验中尝试使用PP333代替嘧啶醇，但结果发现仍以嘧啶醇的效果更好，这与高建明等[4]的研究结果不同，可能与组培材料的基因型不同有关。

外植体选择是影响植物组织培养成败的重要环节之一。 芦笋笋尖部分由鳞片包裹着腋芽紧密排列而成，单个3～5 cm 的笋尖就可以获得15～20个5～10 mm 的腋芽，取材方便，材料充足，这为组织培养提供了便利条件。 由于腋芽容易诱导产生芽丛，本研究不进行芽增殖和伸长的单独培养，而是探索了直接从腋芽到再生植株的一步培养条件，结果表明，将腋芽转接在1/2MS＋0.05 mg/L NAA＋0.1 mg/L KT＋1.0 mg/L 嘧啶醇＋1.0 mg/L IBA＋2%蔗糖＋0.65%琼脂培养基上进行生根培养，30 天左右就可以生根，但此时芽生长缓慢，培养45 天左右根长可达1 cm 左右；培养至60 天左右时，具Ⅰ型根的植株根长可迅速伸长至3 ～5 cm；培养70 天后即可将生长健壮的生根苗进行炼苗移栽，再生周期与通过愈伤组织诱导再生的相比大幅缩短。

本研究以Y14 芦笋为材料，建立了以腋芽为外植体直接诱导生根成苗的芦笋组培快繁体系，该体系步骤简单，获得再生苗所用时间短，生根质量高，大大提高了快繁育苗的效率，对芦笋优异亲本材料的繁殖和新品种培育都具有重要意义。