基于超快速气相电子鼻对不同产地枸杞子快速识别及气味差异物质研究

赵秋龙,江群艳,严辉,瞿城,郭盛,樊欢,包蓉蓉,何润天,康宏杰,段金廒

(1.南京中医药大学中药资源产业化与方剂创新药物国家地方联合工程研究中心/江苏省中药资源产业化过程协同创新中心/国家中医药管理局中药资源循环利用重点研究室,江苏 南京 210023;2.宁夏枸杞创新中心,宁夏 银川 750002)

枸杞子为茄科植物宁夏枸杞LyciumbarbarumL.的干燥成熟果实,始载于《神农本草经》,气微,味甜,具有滋补肝肾,益精明目的功效[1]。现代研究表明,枸杞子主要含多糖、生物碱、类胡萝卜素、黄酮等化学成分[2],具有抗衰老[3]、抗高血压[4]、抗肿瘤[5]、降血糖[6]、降血脂[7]及神经保护[8]等药理活性。目前枸杞子主要分布于甘肃、内蒙古、宁夏、新疆和青海等地[9-10],但由于气候、土壤不同,各地枸杞子的气味可能存在一定差异。目前,陈栋杰等[11-12]已利用电子舌测定不同产地枸杞子的“味”以描述其性状特征;虽有通过电子鼻对枸杞子的“气”进行研究的报道[13-15],但收集的样品来源单一、样本量少。本研究基于超快速气相电子鼻对56批枸杞子样品进行分析,结合判别因子分析(Discriminant factor analysis,DFA)、卷积神经网络(Convolutional neural networks,CNN)、主成分分析(Principal component analysis,PCA)及偏最小二乘判别分析(Partial least squares discriminant analysis,PLS-DA)比较五大产区枸杞子药材的差异[16-17],为枸杞子药材的质量控制和综合利用提供依据。

1 材料

1.1 仪器与试药

Heracles Neo型超快速气相电子鼻(配备PAL RSI型全自动顶空进样器、MXT-5非极性毛细管柱、MXT-1701中极性毛细管柱,法国Alpha Mos公司);GA-380N型低噪音空气泵(北京中兴汇利科技发展有限公司);GH-380N型高纯氢气发生器(北京中兴汇利科技发展有限公司);Mettler Toledo XS105型电子分析天平(瑞士Mettler公司);电热鼓风干燥机(上海一恒科学仪器有限公司)。

正构烷烃混合对照品(批号:A0168401,每100 g混合物中含正构烷烃0.02～53.27 g),购自美国Restek公司。

1.2 枸杞子样本采集

于甘肃、内蒙古、宁夏、青海及新疆采集56批栽培枸杞子样品(2018、2019年7～8月),经南京中医药大学严辉教授鉴定为茄科植物宁夏枸杞LyciumbarbarumL.的干燥成熟果实,具体信息见表1。

表1 不同产地枸杞子信息表Table 1 Information of Lycium barbarum L. from distinct origins

2 方法与结果

2.1 供试品制备

取大小形状均匀的枸杞子,于55 ℃烘箱中通风烘干,去除冷藏保存中产生的冷凝水。取出冷却至室温,粉碎过3号筛,密封备用。

2.2 单因素考察[18]

2.2.1 样品用量 设置孵化温度70 ℃,孵化时间20 min,进样量5 000 μL,考察同一样品(编号S25)的不同用量(1、2、3、4、5 g)对气味色谱峰峰面积和峰形的影响。结果显示,随着样品用量增加,气味峰的峰面积也逐渐增加,峰形良好,见图1。当样品用量为4 g或5 g时,峰面积增加不明显,故选择样品用量为3 g。

图1 不同样品用量、进样量、孵化温度及孵化时间对峰面积的影响Fig.1 The influence of distinct sample dosage, injection volumes, incubation temperatures and time on peak area

2.2.2 进样量 取枸杞子(编号S25)粉末3 g,精密称定,设置孵化温度70 ℃,孵化时间20 min。考察不同进样量(1 000、2 000、3 000、4 000、5 000 μL)对气味色谱峰峰面积和峰形的影响。结果显示,随着进样量增加,气味峰的峰面积均逐渐增大,且当进样量在5 000 μL时,峰形良好,见图1,故选择进样量为5 000 μL。

2.2.3 孵化温度 取枸杞子(编号S25)粉末3 g,精密称定,设置孵化时间20 min,进样量5 000 μL。考察不同孵化温度(40、50、60、70、80 ℃)对气味色谱峰峰面积和峰形的影响。结果显示,随着温度升高,气味峰的峰面积先增大后减小,当温度为70 ℃时,峰面积最大,见图1,故选择孵化温度为70 ℃。

2.2.4 孵化时间 取枸杞子(编号S25)粉末3 g,精密称定,设置孵化时间20 min,孵化温度70 ℃,进样量5 000 μL。考察不同孵化时间(10、15、20、25、30 min)对气味色谱峰峰面积和峰形的影响。结果显示,孵化20 min后气味峰峰面积无明显增大,趋于饱和稳定,见图1,故选择孵化时间为20 min。

2.3 检测条件

色谱柱为低极性MXT-5(交联5%联苯/95%二甲基聚硅氧烷)、中极性MXT-1701(交联14%氰丙基苯/86%二甲基聚硅氧烷)金属毛细管柱,规格均为10 m×0.18 mm×0.4 μm;样品瓶规格为20 mL;样品用量为3 g,进样量为5 000 μL,孵化温度为70 ℃,孵化时间为20 min;进样速度为125 μL·s-1;进样持续时间为45 s;进样口温度为200 ℃,捕集阱补集温度为50 ℃;捕集阱分流速度为10 mL·min-1;捕集持续时间为50 s;捕集阱最终补集温度为250 ℃;色谱柱初始温度为50 ℃,程序升温(以0.5 ℃·s-1升至80 ℃,以1 ℃·s-1升至100 ℃,以3 ℃·s-1升至250 ℃,保持20 s);采集时间为150 s;火焰离子化检测器(FID)增益为12[19]。

2.4 样品的进样分析

样品在超快速气相电子鼻Heracles上进行测定分析,每份样品平行测定2次,准确吸取3 g枸杞子样品于20 mL的电子鼻专用顶空瓶中,使用PTFE隔垫密封,将准备好的样品置于自动进样器装置上,采用顶空进样进行分析。

2.5 方法学考察

取枸杞子(编号S25)粉末约3 g,共6份,精密称定,按“2.3”项下检测条件进行分析,记录峰面积,考察精密度和重复性;取枸杞子(编号S25)粉末约3 g,共6份,精密称定,分别于室温下放置0、2、4、8、12、24 h后按“2.3”项下检测条件进行分析,记录峰面积,考察样品的稳定性。结果显示,样品气味峰峰面积的相对标准偏差(RSD)在2.19%～6.27%之间,保留时间的RSD值在0.03%～0.13%之间,表明该方法精密度高,重复性好,室温下放置24 h内稳定性良好。

2.6 不同产地枸杞子气味指纹图谱研究

2.6.1 指纹图谱的建立和分析[20]按照“2.3”项下的检测条件,通过超快速气相色谱电子鼻对56批枸杞子进行检测。以MXT-5色谱柱扣除空白后采集的信号为主,将所得图谱信息导入OriginPro 2021软件,获得枸杞子的气味指纹图谱,见图2;各产地特征指纹图谱的比较,见图3;13个特征峰相对峰面积热图,见图4;不同产地气味色谱平均峰面积,见表2。结果表明,枸杞子气味指纹图谱中共检出13个共有峰,不同产地枸杞子气味峰的数量没有差异,而峰面积明显不同。此外,60 s前所出的气味峰较密集、峰面积大;60 s后所出的气味峰较少、峰面积小。

图2 56批枸杞子样品的气味指纹图谱(S1～S56)Fig.2 Odor chromatogram fingerprints of 56 batches of Lycium barbarum L. (S1-S56)

注:P1～P13.色谱峰1～13;GS1～GS14.甘肃1～14;NM1～NM10.内蒙古1～10;NX1～NX15.宁夏1～15;XJ1～XJ8.新疆1～8;QH1～QH9.青海1～9图4 不同产地枸杞子气味峰相对峰面积热图分析Fig.4 Heatmap analysis of odor chromatogram relative peak area of distinct origin-derived Lycium barbarum L.

表2 不同产地枸杞子13个特征气味峰的平均峰面积Table 2 The average area of 13 characteristic odor chromatogram peaks from distinct origin-derived Lycium barbarum L.

2.6.2 枸杞子气味定性分析研究 为明确不同产地枸杞子气味特征成分组成,对比正构烷烃nC6～nC16混合对照品的保留时间,将“2.5.1”项下所得枸杞子气味指纹图谱中13个共有峰保留时间(tR)转换为Kovats保留指数(RI),并与AroChemBase数据库比对[21-22]鉴定出13个可能的共有化合物,具体见表3及图5。结果显示,峰面积最大的2号峰可能为丙烯醛,峰面积最小的9号峰可能为糠醛。图5气味轮显示,13个化合物主要分为6个主观感知类别,被感知为“辛辣的”的化合物个数最多。

图5 不同产地枸杞子气味特征成分(中圈)、主观感知类别(内圈)及相关气味描述(外圈)的气味轮Fig.5 Flavor wheel of 13 main odor characteristiccomponents(middle circle), subjective perception category(inner circle)and related odor description(outer circle)in distinct origin-derived Lycium barbarum L.

2.6.3 不同产地枸杞子的快速鉴别分析

2.6.3.1 DFA判别模型的建立 为分析不同产地枸杞子的气味差异,实现对其快速鉴别,本实验使用Alpha Soft 17.0软件对不同产地枸杞子的气味色谱图进行DFA[23],具体见图6。结果显示,DFA二维模型中,横纵坐标两判别因子的累积区分指数为81.903%(DF1:66.338%;DF2:15.565%);DFA三维模型中,三判别因子的累积区分指数为94.198%(DF1:66.338%;DF2:15.565%;DF3:12.295%),表明该判别模型能充分代表所有样品的气味信息。

注:GS.甘肃;NM.内蒙古;NX.宁夏;XJ.新疆;QH.青海图6 不同产地枸杞子的超快速气相电子鼻信号DFA分析Fig.6 The DFA analysis of distinct origin-derived Lycium barbarum L. based on ultra-fast gas phase electronic nose

甘肃产枸杞子与其他四产区药材在DF1上有明显差异,宁夏产枸杞子与内蒙古产枸杞子在DF2上有明显差异,青海产枸杞子与新疆产枸杞子在DF1与DF2上均有差异。从二维和三维模型上,56批枸杞子样品均能得到分离,所有样品按产区分为5类,说明超快速气相电子鼻可快速鉴别不同产地枸杞子。

2.6.3.2 CNN判别模型的建立 利用枸杞子13个气味峰数据构建CNN模型[24],随机分为训练集和测试集,训练集共有45(×2)批样品,测试集共10(×2)批样品。将13个气味峰峰面积数据作为输入层。卷积层中,一维卷积层为尺寸2×1,数目32,二维卷积层尺寸2×32,数目64。输出卷积层结果时,通过ELU激活函数对卷积结果进行非线性映射。池化层选择平均池化法,池化窗口为2×2。训练模型时,采用交叉熵函数来反应误差。最终,获得基于超快速气相电子鼻的CNN判别模型,模型训练的学习率为初始值0.000 1,以1/e为衰减指数,随训练次数增加逐步衰减。模型的训练集平均准确率为100%,测试集平均准确率为80.5%,其中前两轮测试集准确率高达95.2%,说明该模型对不同产地的枸杞子可进行产地判别,具体见表4。

表4 不同产地枸杞子的超快速气相电子鼻信号CNN分析Table 4 The CNN analysis of distinct origin-derived Lycium barbarum L. based on ultra-fast gas phase electronic nose

2.6.4 不同产地枸杞子的主要气味差异物质分析

2.6.4.1 不同产地枸杞子的主要气味成分差异初步分析 为分析不同产地枸杞子的气味差异成分,先利用SPSS软件对枸杞子13个气味峰的峰面积进行正态性检验,将符合正态分布的气味峰进行单因素方差分析,不符合正态分布的气味峰进行非参数检验(K-W检验),具体见图7。结果显示,五大产区枸杞子主要在8(己醛)、9(糠醛)、10(二甘醇单乙醚)、11(硝基苯)及12(正庚基丙烯酸酯)号气味峰上有明显差异。

注:GS.甘肃;NM.内蒙古;NX.宁夏;XJ.新疆;QH.青海;各组间比较,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.000 1。图7 不同产地枸杞子13个气味峰峰面积的比较Fig.7 The odor chromatogram peak area comparison of distinct origin-derived Lycium barbarum L.

2.6.4.2 PCA结果 为进一步鉴别不同产地枸杞子的气味差异成分,将“2.5.4.1”项下所得5个差异成分己醛(8)、糠醛(9)、二甘醇单乙醚(10)、硝基苯(11)及正庚基丙烯酸酯(12)的峰面积作为变量,利用SIMCA 14.1软件进行PCA[25],具体见图8。结果显示,由PCA得分图所得2个主成分的累计贡献率为97.30%(PC1 85.9%,PC2 11.4%),模型预测Q2值为0.616(>0.5),说明该模型能较好地反映样品中的气味信息[26]。5个不同产地枸杞子样本在PCA图上能区分开,有明显差异。

图8 不同产地枸杞子气味成分的PCA分析Fig.8 The PCA analysis of odor components from distinct origin-derived Lycium barbarum L.

载荷图上,己醛、糠醛、二甘醇单乙醚、硝基苯及正庚基丙烯酸酯这5个成分距原点均较远,表明5个成分对区分不同产地枸杞子贡献较大[27]。

2.6.4.3 PLS-DA结果 PCA是一种无监督的分析方法,在确定差异成分时,无法忽略组内差异与随机误差。为进一步探究不同产地枸杞子的气味差异物质,采用有监督的PLS-DA[28],具体见图9。结果显示,56批枸杞子被分为5类,不同产地的枸杞子之间有差异,与PCA分析结果互相验证。

注:GS.甘肃;NM.内蒙古;NX.宁夏;XJ.新疆;QH.青海

此外,在变量重要性排序(Variable importance in projection,VIP)图上,己醛(VIP=1.317)、糠醛(VIP=1.020)的VIP值均>1[29],表明己醛与糠醛是5个产地枸杞子的气味差异物质。由表2可知,枸杞子中,按己醛含量大小的产地排序为:内蒙古>甘肃>宁夏>新疆>青海,内蒙古产枸杞子中的己醛含量是青海产枸杞子中己醛的1.63～3.54倍,是新疆产枸杞子中己醛的1.47～2.49倍;按糠醛含量大小的产地排序为:甘肃>新疆>宁夏>青海>内蒙古,甘肃产枸杞中的己醛含量是内蒙古产枸杞子中己醛的1.17～2.37倍,是青海产枸杞子中己醛的1.15～2.01倍。

3 讨论

本研究采用Heracles超快速气相电子鼻技术从不同产地枸杞子中鉴定出氯乙烷、丙烯醛、叔丁醇等13种共有化合物,通过绘制“气味轮”发现,除正庚基丙烯酸酯外的12个化合物,是对枸杞子气味起到关键作用的化合物。由VIP值图可知,己醛(VIP=1.3)和糠醛(VIP=1.03)是不同产地枸杞子的主要差异化合物,可作为区分枸杞子产地的潜在差异气味分子指标。枸杞子中己醛含量高低的产地排序为:内蒙古>甘肃>宁夏>新疆>青海;糠醛含量高低的产地排序为:甘肃>新疆>宁夏>青海>内蒙古。建立DFA、CNN判别模型及PCA和OPLS-DA化学计量模型,DFA模型的判别因子累积区分指数为81.903%,CNN的测试平均准确率为80.5%,PCA模型的累计贡献率为97.30%,OPLS-DA模型的累计贡献率为97.20%,说明以上模型均能区分不同产地枸杞子气味,能够对枸杞子样品气味进行快速鉴别分析。因此,本研究通过Heracles超快速气相电子鼻技术[30],不仅确定枸杞子气味贡献程度较大的挥发性气味化合物,还可以实现不同产地枸杞子快速鉴别,为其质量控制和产地溯源提供了科学依据[31-33]。