丹栀调脂汤对高脂诱导MAFLD大鼠PI3K/AKT/FOXO1信号通路的影响

刘玉玉,隋淼,蒋小飞,汤楠楠,王智明

(1.安徽中医药大学研究生院,安徽 合肥 230000;2.南京中医药大学徐州附属医院,江苏 徐州 221000)

代谢相关脂肪性肝病(Metabolic associated fatty liver disease,MAFLD)是指在肝脂肪变性的基础上,合并超重/肥胖、2型糖尿病、代谢功能障碍三项之一的代谢功能障碍相关的肝脏疾病[1],目前全球患病率高达25%,已成为最常见的慢性病之一。MAFLD可以随着代谢失衡迅速进展为脂肪性肝炎、肝纤维化、肝硬化,甚至诱发肝细胞性肝癌。因此,研究MAFLD的发病机制并寻求有效治疗药物,已成为当前研究的热点。

研究表明,脂质代谢紊乱和胰岛素抵抗是MAFLD发展的中心环节[2],肝脏脂肪沉积与胰岛素抵抗之间存在较强的双向关系。而PI3K/AKT信号通路被认为是糖脂代谢调节的关键因子,与肝脏胰岛素抵抗密切相关[3]。丹栀调脂汤是南京中医药大学徐州附属医院的院内协定方,临床已应用多年。课题组前期研究发现[4-6]丹栀调脂汤能有效降低肥胖型2型糖尿病患者的血糖,改善胰岛素抵抗,减轻颈动脉斑块沉积,改善机体炎症状态,但其具体机制并不明确。本研究拟通过观察丹栀调脂汤对高脂诱导的MAFLD大鼠糖脂因子表达的影响,及对PI3K/AKT/FOXO1信号通路的作用,为丹栀调脂汤治疗MAFLD提供科学依据。

1 材料

1.1 动物

7周龄SPF级SD雄性大鼠30只,体质量180～200 g,购于斯贝福(北京)生物技术有限公司,实验动物生产许可证号:SCXK(京)2019-0010,动物饲养于SPF级屏障实验室,单笼饲养,饲养温度维持21～25 ℃,湿度维持50%～60%,采取12 h/12 h模式进行昼夜明暗交替。高脂饲料购自斯贝福(北京)生物技术有限公司,配方为83.5%基础饲料、15%猪油及1.5%胆固醇。实验方案经南京中医药大学动物伦理委员会批准,批号:202103A009。

1.2 药物

丹栀调脂汤购自南京中医药大学徐州附属医院,方由柴胡12 g,丹皮10 g,栀子10 g,黄芩10 g,黄连10 g,枸杞子10 g,荔枝核30 g,丹参30 g,蒺藜30 g,荷叶10 g,大黄10 g组成,采用传统水煎法提取后浓缩,制成生药含量为5 g·mL-1的丹栀调脂汤高剂量溶液,冷却后储存于4 ℃备用。给药前,分别稀释为中剂量2.5 g·mL-1、低剂量1.25 g·mL-1。

1.3 试剂

TG(货号:A110-1-1)、HDL-C(货号:A112-1-1)、TC/TCH(货号:A111-1-1)、LDL-C(货号:A113-1-1)试剂盒购自南京建成,大鼠Insulin(货号:SEKR-0033)、GPT/ALT(货号:BC1555)、GOT/AST(货号:BC1565)、FFA(货号:BC0595)试剂盒购自北京索莱宝,PI3K抗体(货号:ab191606)购自Abcam,p-PI3K抗体(货号:17366)、FOXO1抗体(货号:2880)、Phospho-1抗体(货号:9461)、p-AKT抗体(货号:4060)、AKT抗体(货号:9272)、GAPDH抗体(货号:5174)、二抗Anti-rabbit IgG(H+L)(货号:14708)购自CST。

1.4 仪器

I20-1型体重秤(武汉自动化仪表厂);Accu-Chek Performa型血糖仪(德国Roche公司);Centrifuge 5427R高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司);7600型全自动生化分析仪(日本Hitachi公司);TY-80B/80S脱色摇床(江苏普阳);RM2016型轮转式切片机(德国Leica公司);酶标仪Mono422(美国Biotek公司);电泳仪(美国Bio-Rad公司);蛋白印迹-多功能成像系统(美国BioRad公司);光学显微镜(日本Olympus公司)。

2 方法

2.1 动物造模及药物干预

将30只SD雄性大鼠常规适应性饲养1周后,称体质量,随机分为2组:正常组6只,予基础饲料喂养;MAFLD模型组24只,予高脂饲料喂养,连续喂养8周诱发MAFLD大鼠模型,血脂、血糖、胰岛素等代谢指标异常即判定为造模成功。

将24只成模的MAFLD模型大鼠随机分为模型组及丹栀调脂汤高剂量、中剂量、低剂量组,每组6只。根据前期研究[4-6]以及丹栀调脂汤临床等效剂量换算[7],丹栀调脂汤低、中、高剂量组分别予丹栀调脂汤5.1、10.2、20.4 g·kg-1·d-1,每日1次,正常组与模型组予等体积的生理盐水,连续灌胃8周后取材。末次给药后禁食不禁水,12 h后,将大鼠麻醉,打开大鼠腹腔,腹主动脉取全血标本置于促凝管中,离心后将血清储存于-20 ℃冰箱保存,留取肝脏组织冻存于液氮中。

2.2 观察指标

2.2.1 一般情况 每日观察大鼠精神状态、皮毛、活动、饮食及存活等情况,每周称取大鼠体质量。

2.2.2 肝脏病理形态学观察 肝脏用10%福尔马林固定,组织冰冻切片,油红O染色。封片后将切片放置显微镜下拍照。

2.2.3 血清生化指标检测 检测大鼠血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、血糖(GLU)、游离脂肪酸(FFA)、胰岛素(INS)水平。采用稳态模型评估胰岛β细胞功能,HOMA-IR=空腹血清胰岛素×空腹血糖/22.5。

2.2.4 Western blot检测大鼠肝脏组织PI3K/AKT/FOXO1通路蛋白的表达 取约100 mg肝脏组织按全蛋白提取试剂盒说明书操作要求提取总蛋白,用BCA法进行蛋白定量后,加入上样缓冲液,100 ℃水浴变性。将蛋白样品加入SDS-PAGE凝胶中进行电泳。电泳结束后开始转模,封闭,加入1∶1 000比例稀释的一抗,4 ℃摇床孵育过夜。次日洗膜,按照1∶3 000稀释二抗,室温孵育1 h。采用凝胶成像分析系统检测各蛋白条带。

2.3 统计学方法

3 结果

3.1 高脂饮食诱导8周后大鼠状态、体质量及代谢指标的变化

正常组大鼠一般状况良好,体质量缓慢且均衡增加;模型组大鼠精神状态较差,毛发光泽变弱,体质量增加明显且快速。如图1所示,高脂饲养后,大鼠的体质量、GLU、INS及TG水平与正常组相比明显升高(P<0.01),HDL-C水平明显降低(P<0.01)。

注:Control.正常组(n=6);HFD.模型组(n=24)。与Control组比较,图1 高脂饮食诱导对大鼠体质量及代谢指标的影响Fig.1 Effect of HFD induction on body mass and metabolic indicators in rats

3.2 丹栀调脂汤对MAFLD大鼠体质量、GLU、INS水平及HOMA-IR的影响

给药8周后,与正常组相比,模型组大鼠体质量增加明显,GLU、INS水平及HOMA-IR指数明显升高(P<0.01,P<0.001);与模型组相比,丹栀调脂汤各剂量组体大鼠精神状态较好,毛发有光泽,体质量、GLU及INS水平均有不同程度的降低,并呈剂量依赖性(P<0.05,P<0.01,P<0.001);丹栀调脂汤中、高剂量组HOMA-IR指数明显低于模型组(P<0.01),见图2。

注:Control.正常组;HFD.模型组;L-DZTZ.丹栀调脂汤低剂量组;M-DZTZ.丹栀调脂汤中剂量组;H-DZTZ.丹栀调脂汤高剂量组。与Control组比较,##P<0.01,###P<0.001;与HFD组比较,图2 丹栀调脂汤对高脂大鼠体质量、GLU、INS水平及HOMA-IR的影响Fig.2 Effect of Danzhi Tiaozhi Decoction on body mass, blood sugar, insulin levels, and HOMA-IR in HFD rats

3.3 丹栀调脂汤对MAFLD大鼠肝功能、血脂及FFA水平的影响

如图3所示,与正常组相比,模型组ALT、AST、TG、TC、LDL-C及FFA水平明显升高(P<0.01);与模型组相比,丹栀调脂汤各剂量组TG、TC、LDL-C、ALT、AST及FFA水平明显降低(P<0.05,P<0.01);与正常组相比,模型组HDL-C水平明显降低(P<0.01),高剂量丹栀调脂汤能够升高HDL-C水平(P<0.05)。

注:Control.正常组;HFD.模型组;L-DZTZ.丹栀调脂汤低剂量组;M-DZTZ.丹栀调脂汤中剂量组;H-DZTZ.丹栀调脂汤高剂量组。与Control组比较,##P<0.01;与HFD组比较,

3.4 丹栀调脂汤对MAFLD大鼠肝脏脂质沉积的影响

正常组大鼠肝脏组织中细胞核呈蓝色,未见明显橘红色脂滴,肝细胞间隙清晰,肝窦结构正常;相较于正常组,模型组可观察到弥漫性的红染脂滴,肝细胞肿大且排列紊乱,空泡,相邻细胞脂滴融合,脂质沉积明显增加,细胞核被挤向周边;而各给药组肝细胞脂滴、排列结构较模型组均有不同程度的改善。见图4。

注:Control.正常组;HFD.模型组;L-DZTZ.丹栀调脂汤低剂量组;M-DZTZ.丹栀调脂汤中剂量组;H-DZTZ.丹栀调脂汤高剂量组图4 丹栀调脂汤对高脂大鼠肝脏组织的病理学影响(油红O,×100)Fig.4 Pathological effects of Danzhi Tiaozhi Decoction on liver tissue of HFD rats (Oil Red O, × 100)

3.5 丹栀调脂汤对MAFLD大鼠肝脏中TG、TC的影响

与正常组相比,模型组大鼠肝脏中TG、TC水平明显升高(P<0.01);相较于模型组,丹栀调脂汤各剂量组大鼠肝脏中TG明显降低(P<0.05,P<0.01,P<0.05),但TC水平未见明显下降,见图5。

注:Control.正常组;HFD.模型组;L-DZTZ.丹栀调脂汤低剂量组;M-DZTZ.丹栀调脂汤中剂量组;H-DZTZ.丹栀调脂汤高剂量组。与Control组比较,##P<0.01;与HFD组比较,图5 丹栀调脂汤对高脂大鼠肝脏中TG、TC的影响Fig.5 Effect of Danzhi Tiaozhi Decoction on TG and TC in the liver of HFD rats

3.6 丹栀调脂汤对MAFLD大鼠PI3K/AKT/FOXO1信号通路相关蛋白的影响

与正常组比较,模型组肝脏组织PI3K、AKT、FOXO1蛋白磷酸化表达明显降低(P<0.01)。与模型组相比,丹栀调脂汤各剂量组PI3K、FOXO1蛋白磷酸化水平明显升高(P<0.01);丹栀调脂汤中、高剂量组AKT蛋白磷酸化水平明显升高(P<0.01)。见图6。

注:Control.正常组;HFD.模型组;L-DZTZ.丹栀调脂汤低剂量组;M-DZTZ.丹栀调脂汤中剂量组;H-DZTZ.丹栀调脂汤高剂量组。与Control组比较,##P<0.01;与HFD组比较,图6 丹栀调脂汤对高脂大鼠PI3K/AKT/FOXO1信号通路相关蛋白表达的影响Fig.6 Effect of Danzhi Tiaozhi Decoction on the expression of PI3K/AKT/FOXO1 signaling pathway related proteins in HFD rats

4 讨论

现代医学研究认为,久坐不动、膳食营养不均衡及机体糖脂代谢障碍等与MAFLD发生密切相关。中医学并没有与MAFLD相对应的明确记载,既往学者根据其临床表现多将其归属于“痰浊”“积聚”“肥气”等范畴[8]。脾主运化,恣食肥甘厚味则致运化不及,酿生痰浊膏脂,土壅则木郁,影响肝之疏泄,膏脂积聚于肝,积久化热生火,以致内热,表现为肝胃郁热[8]。丹栀调脂汤以丹栀逍遥散为底方[4-6],以君药丹皮清肝经血分之热,柴胡为臣疏肝理气,舒展少阳三焦气机,栀子清肝经气分之热,与柴胡共用,呈清热疏肝之功,辅以大黄、黄连、黄芩三黄涤三焦湿热,佐以白蒺藜、枸杞子、荔枝核以疏肝解郁,使木气调达,荷叶为使。诸药合用,恰中MAFLD肝胃郁热之病机,共奏疏肝理气,清热祛湿之效。现代药理学也表明,栀子[9]中的栀子苷能明显改善NASH大鼠肝组织中IL-1β、IL-6、TNF-α等炎症因子的表达,降低血浆LPS水平。柴胡[10]中柴胡皂苷和柴胡多糖能够保护肝细胞,降低NASH大鼠血脂、GLU和游离脂肪酸水平,改善糖脂代谢紊乱状态。TanⅡA是丹参的提取物,它能通过调节肝脏低密度脂蛋白受体、肝脏SREBP-2以及相关胆固醇基因的表达来减轻高脂血症大鼠肝脏中的脂质沉积[11]。荷叶生物碱能通过活化AMPK信号通路,减轻胰岛素抵抗等[12]。

MAFLD是一种复杂的多因素疾病,涉及遗传、代谢和环境等因素[13],与全身能量代谢功能紊乱密切相关。能量摄入和消耗之间的失衡导致脂肪在组织中堆积,当累积超过了脂肪组织重塑的能力时,一方面,导致FFA和促炎细胞因子的释放增加,骨骼肌和脂肪组织中胰岛素抵抗的加重,脂毒性增加,出现异位脂肪沉积,特别是肝脏中的脂肪积累;另一方面,多余的FFAs和葡萄糖可以转化为肝脏脂肪从头合成(DNL)的底物,进一步增加FFAs的摄取,减少VLDL-TG的分泌,促进肝脏脂肪堆积[14]。随着脂肪在肝脏中的积累,肝细胞代谢紊乱,又可以导致脂肪输出率增加,进一步加重内质网应激、氧化应激。因此,改善肝脏组织中的胰岛素抵抗及减少脂质沉积是延缓MAFLD发生发展的关键。课题组前期研究发现,丹栀调脂汤能够有效地降低2型糖尿病患者血清INS、CRP、TNF-α、IL-6水平[4-5],改善脂肪肝患者的肝功能和血脂[6]。本研究中,我们发现高脂饲养的大鼠肝脏胞浆内充满大小不等的脂滴,肝细胞存在肿胀,有散在的点状坏死及炎细胞浸润,提示存在肝脏脂肪变性,其体质量、生化指标也证实存在胰岛素抵抗及高脂血症。丹栀调脂汤可以明显改善高脂诱导大鼠HOMA-IR,降低TG、TC、LDL-C及FFA水平,呈剂量依赖性。同时,高剂量的丹栀调脂汤能够有效地升高HDL-C。肝脏病理结果显示,和模型组相比,丹栀调脂汤各剂量组肝细胞肿胀明显减轻,胞浆内脂滴明显减少,说明丹栀调脂汤能够有效改善糖脂代谢,减轻肝脏脂肪沉积,延缓MAFLD的进展。

PI3K/AKT通路在胰岛素信号通路中发挥重要作用,被认为是与糖异生和糖原合成相关的关键调节因子[3],在调控胰岛β细胞的凋亡、增殖,调节胰岛素敏感性,缓解胰岛素抵抗等方面具有重要作用[15]。作为PI3K重要的调节亚基,PI3K p85可与RTK相互作用而激活PI3K,因此,本研究PI3K p85亚基为检测的一个重要指标。激活后的PI3K通过影响磷酸化AKT来介导胰岛素和多种生长因子对糖代谢的调节,而AKT通过磷酸化下游底物参与葡萄糖和脂质代谢。一方面,PI3K/AKT通路激活可以抑制脂肪生成,延缓过多的脂质沉积,从而缓解肝脏脂肪变性[16]。另一方面,激活的PI3K/AKT通路通过促进FOXO1磷酸化,促成FOXO1核排斥,从而抑制肝葡萄糖异生[17]。FOXO1是位于PI3K/AKT通路下游的关键因子,在脂代谢、葡萄糖代谢和氧化应激反应等信号通路的调节中起重要作用[18],其能够通过增加自噬因子和糖异生关键酶的表达来调节脂肪和葡萄糖代谢[19]。研究表明[17,20-21],p-FOXO1蛋白表达的增加可以增强组织中的胰岛素敏感性,改善胰岛素抵抗,调节肝脏脂质代谢。本实验中,模型组大鼠肝脏PI3K、AKT、FOXO1蛋白磷酸化水平明显低于正常组,丹栀调脂汤可以明显上调高脂抑制下的PI3K、AKT、FOXO1蛋白磷酸化水平,并呈剂量依赖性。

综上所述,丹栀调脂汤可以通过PI3K/AKT信号通路,进一步调控FOXO1磷酸化,调节糖脂代谢,增加肝脏组织中胰岛素敏感性,从而改善胰岛素抵抗,减轻肝脏脂质沉积,延缓MAFLD的发生发展。