葡萄属植物遗传转化影响因素研究进展

张天玥 赵若岑

摘 要：葡萄作为世界上重要的经济类果树作物之一，在酿酒、鲜食、制干、制汁、制罐、砧木等方面的应用十分广泛，为人类创造了明显的社会效益、经济效益和生态效益。自美国学者1990年在沙地葡萄（Vitis rupestris）中首次成功获得遗传转化植株，葡萄属植物遗传转化发展迅猛。多年研究证实利用分子育种建立完整、高效的葡萄遗传转化体系对葡萄基因改良有着至关重要的作用。阐述了葡萄属植物遗传转化的4个阶段，并对遗传转化的影响因素进行具体分析，针对这些影响因素进行资料收集和对比研究，总结葡萄遗传转化体系研究现状并提出展望，以期对葡萄基因改良研究提供参考。

关键词：葡萄；遗传转化；影响因素

文章编号：2096-8108（2023）04-0067-06  中图分类号：S663.1  文献标识码：A

Research Progress on Influencing Factors of Genetic Transformation of Grape Plants

ZHANG  Tianyue，ZHAO  Ruocen

（Faculty of Food and Wine， Ningxia University， Yinchuan Ningxia 750021，China）

Abstract： Grape is one of the most important fruit in the world， which is widely used in wine making， fresh food， drying， juice making， pot making and stock making， and has created considerable social， economic and ecological benefits for human beings. Since American scholars first obtained genetically modified plants in Vitis rupestris in 1990， the genetic transformation of grape plants has developed rapidly. Years of research have confirmed that the use of molecular breeding to establish a complete and efficient grape genetic transformation system plays a vital role in grape genetic improvement. In this paper， the four stages of genetic transformation of grape plants are elaborated， and the influencing factors of genetic transformation are analyzed in detail. Data collection and comparative study of these influencing factors are carried out， and the research status of grape genetic transformation system is summarized and prospects are proposed in order to provide reference for grape genetic improvement research.

Keywords：grape; genetic transformation; influencing factors

葡萄作為世界上重要的经济类果树作物之一，在酿酒、鲜食、制干、制汁、制罐、砧木等方面的应用十分广泛，为人类创造了明显的社会效益、经济效益和生态效益［1-2］。由于葡萄属植物染色体高度杂合，遗传背景复杂，采用常规杂交育种获得葡萄新品种周期长，工作繁琐，已不适应当今产业高速发展的需求。与传统的育种技术相比，分子育种可以克服偶然性大、育种年限长和后代数量庞大不易筛选等缺点，能够精确改进目前应用品种的不足，实现多个优良基因（性状）的聚合。因此，利用分子育种建立完整、高效的葡萄遗传转化体系对葡萄属植物品种改良有着至关重要的作用。

欧洲葡萄（ Vitis vinifera L.）具有较高的经济价值，品质优良且栽培广泛，但其抗逆性较差，改良优质葡萄品种抗逆性是葡萄育种的目标之一［3］。近年来葡萄转基因研究主要采取农杆菌介导法进行，基因枪转化法的应用复杂且花费高，使用次数相对较少。美国学者MullinsMG等人自1990年首次在沙地葡萄（Vitis rupestris）中获得转基因植株，Scorza R和Franks tricia以‘无核白（ Vitis vinifera L.‘Thompson seedless）和‘萨娜（ Vitis vinifera L.‘Sultana）为材料，转外壳蛋白基因和uidA/nptⅡ基因的植株已被分别获得［4-6］。21世纪初，周鹏等［7］人在葡萄中导入人胰岛素样生长因子IGF-I基因，孙仲序等［8］人将鲁贝葡萄花丝所谓外植体诱导体胚，最终获得表达甜菜碱醛脱氢酶基因的葡萄，鲍睿等［9］人建立了欧洲葡萄无核白遗传转化体系，张莹［10］于2021年初步建立‘霞多丽种子遗传转化体系，葡萄属植物基因遗传转化技术日益广泛应用于葡萄属植物的研究。

多年研究证实利用分子育种建立完整、高效的葡萄遗传转化体系对葡萄基因改良有着至关重要的作用。随着分子育种技术的不断精进，研究者通过器官发生（Organogenesis）和胚状体发生（Somatic embryogenesis）两大途径建立了葡萄再生体系。遗传转化体系是以再生体系为基础建立的。基因型、受体类型、培养基类型和转化方式等都是遗传转化体系的重要影响因素，本文针对这些影响因素进行资料收集和对比研究，分析葡萄遗传转化体系研究现状并提出展望，以期对葡萄基因改良研究提供参考。

1 葡萄属植物遗传转化体系的建立

葡萄属植物遗传转化可以分为以下4个阶段：第1阶段是遗传转化受体系统的建立。这1阶段主要是准备用于遗传转化的受体，主要受到培养途径和培养条件的影响；第2阶段是目的基因的导入。借助各种不同的方法将目的基因高效准确的导入受体，该阶段主要受到目的基因和转化方法的影响；第3阶段是受体生长与植株发育。遗传转化的最终目的是培养转基因植株。这一阶段需要给受体提供适宜的生长环境，使受体继续生长直至成苗，并且将没有成功导入基因的受体筛选出来；第4阶段是目的基因的分析与检测。根据目的基因携带的报告基因，对导入的目的基因进行检测，检验遗传转化是否成功。近年来有重要推进意义的遗传转化报道详见表1，各阶段图片展示详见图1。

2 不同因素对葡萄属植物遗传转化的影响

2.1 受体类型

遗传转化受体系统主要包括器官发生和胚状体发生两大类。近年来，可用于遗传转化受体诱导方法及条件的研究报道甚多，详见表2。器官发生是指在一定诱导条件下，由离体的细胞、组织经分裂、增殖以及再分化，形成根、芽等器官的过程。叶器官和根器官是用于器官发生途径的主要外植体。由表2可以得出，不同品种器官发生的诱导率差异较大，不同外植体诱导率没有普遍规律，且不同品种之间差异较为明显。胚状体发生是指具有胚芽、胚根和胚轴的胚状结构经培养细胞诱导分化后，再生长为一个完整植株的过程［11］。Mauro M C和Scorza R证明了胚性细胞比叶片、叶柄和茎段等有较高的再生能力［5，12］。目前用于遗传转化的有胚性愈伤组织、原胚团和体细胞胚3种类型的胚性组织［13-14］，其中胚性愈伤组织和体细胞胚的报道较多。与茎段，叶片相比，将胚性愈伤组织用作农杆菌侵染转化外植体的优势在于转化胚性愈伤组织能够高频的进行再生植株的转化，通过筛选可以避免嵌合体转化，降低假阳性，从而获得真正意义上的转基因植株。

2.2 培养条件

无论是器官发生途径还是胚状体发生途径，培养条件都是影响外植体生长发育的关键因素。对于某一基因型葡萄的特定外植体而言，必须在某一特定的培养基中和培养条件下才能再生出植株［15］。大量研究表明，培养外植体的基础培养基和激素种类及浓度是最重要的影响因素。不同外植体的最适培养基不同，所以，根据不同的外植体，我们要选用最适合其生长的基础培养基。对于器官发生途径，诱导愈伤组织最适基础培养基为MS和B5，誘导不定芽的最适培养基与品种和外植体类型有很大关系，常用的有MS、NN69和B5培养基。对于胚状体发生途径，诱导体胚常用的基础培养基有NN69、MS、1/2MS、PIV、MC和改良培养基。不同外植体所使用的基础培养基一般不尽相同，含芽茎段和花丝一般接种于1/2 MS基础培养基，而叶柄、叶片和卷须一般接种于NN69基础培养基［16］。有研究表明，在胚状体形成阶段，有利于胚状体生长发育的是低浓度生长素和中低浓度细胞分裂素，其他外源激素则不再需要［17］。

2.3 转化方法

遗传转化体系的建立可以依靠不同的转化方式导入基因，而转化方式不同，对于不同受体材料的转化率也有所不同。目前，主要用于葡萄基因转化的方式有农杆菌介导法和基因枪法。

2.3.1 基因枪法

基因枪法是通过一种类似枪结构的装置，将表面附有外源遗传物质的金属颗粒射入受体，其表面吸附的外源遗传物质也会随之进入细胞［18］。该方法转化效率高、受体细胞类型限制少、操作简单且可控度高，但仪器费用过高，花费较多。研究发现，通过葡萄悬浮细胞均可实现转化，分别获得了基因转化植株和愈伤组织［19-20］。

2.3.2 农杆菌介导法

农杆菌介导法是导入目的基因的主要方法，以其费用低、重复性好、基因沉默现象少、转化周期短以及能转化较大片段等优点而备受科学工作者的青睐。农杆菌株系和菌液浓度对于研究有较大影响，而菌株本身致病力的强弱和外界诱导致病力表达的因素也同样是影响葡萄属植物遗传转化的关键因素［15］。对于农杆菌的种系，大量研究显示，与GV3101、LBA4404等菌株相比，EHA系列的菌株具有更好的转化效果。赵亭亭［21］研究EHA105、GV3101和LBA4404共3种不同的农杆菌菌株对葡萄遗传转化的影响时发现EHA105和GV3101的转化效率显著高于LBA4404，且二者无明显差异，但农杆菌EHA105更易于活化且具有更广泛的适用性。对于菌液浓度，研究人员发现低浓度的农杆菌菌液可以降低植物性毒素带来的作用［22］。Tao J在研究苜蓿时发现菌液浓度（OD600）0.3～0.5时，GUS 的阳性愈伤率明显超出其他浓度［23］。农杆菌介导法也常与基因枪法结合使用来提高转化效率。Bouanama B和Bidney D将微粒轰击和农杆菌介导转化结合应用，发现比常规基因枪转化的转化率提高至少100倍［24-25］。

2.4 抗生素浓度

对于运用农杆菌介导法进行目的基因导入的受体材料，筛选时所用的抗生素的种类、浓度对葡萄遗传转化能否成功至关重要。对于抗生素的选择，卡那霉素在遗传转化中筛选效果比其他的抗生素效果好，在较低浓度下仍然可以有较好的筛选力，而巴龙霉素容易对外植体有过多抑制导致组织无法生长［26］。但后来的研究者认为巴龙霉素可将无效用细胞快速消灭，避免卡那霉素长续性抑制细胞生长［27］。抗生素的种类由载体和农杆菌菌株决定，使用浓度因物种而异，浓度过低会导致出现嵌合体及假转化体；浓度过高，毒性也会过高，使植物细胞无法生存，死细胞也会抑制临近活细胞的生长［28］。因此，进行预试验确定抗生素使用浓度十分重要。经研究发现对于葡萄种子，当卡那霉素为30 mg/L就可起到筛选作用，70 mg/L卡那霉素浓度筛选效果最为明显［29］。当受体生长出子叶胚时，应及时将其转移到成苗培养基中，并黑暗环境下培养［30］。

3 遗传转化中存在的问题及展望

3.1 胚性愈伤诱导困难且嵌合体较多

据介绍，目前研究人员多选择胚性组织作为遗传转化的受体，但胚性愈伤组织的诱导难度较大，过程繁琐复杂，诱导率极低，使遗传转化效率大大降低［16］。直接将器官作为外植体进行再生，可以有效提高再生频率，但很容易在遗传转化时发生嵌合体，而且容易发生变异，很难保证与母株基因型转化后的植物基因型保持一致［31］。因此，探索更有利于遗传转化的再生受体系统和研究各独立品种的最佳受体和再生方案是今后葡萄遗传转化研究的重点之一，如此便能进一步提高胚性愈伤组织的诱导率，有效降低器官再生嵌合体出现的几率。

3.2 基因沉默

基因沉默在葡萄基因工程的研究中是一个普遍存在的现象。共抑制、位置效应、DNA甲基化、反式失活、重复序列等都会引起基因的沉默，基因被成功导入植株却不表达，严重制约了葡萄基因工程的发展，难以让试验与生产实践相结合［32］。基因沉默现象的发生与转基因条件和人为因素也密切相关，所以，深入研究引起沉默的机理，调控转基因过程的各个条件，有利于葡萄属植物基因工程研究的发展。

3.3 潜在生态病害

转基因技术在8年前就成为了全球的热点话题，尽管转基因技术在提高作物产量和质量、改善作物抗逆性等方面发挥作用，但在一定程度上也危害了人体。研究显示，插入外源基因会导致生物体内基因组不稳定，出现各种不良变异，甚至会出现危害人类性状的现象［32］。就转基因而言，它会产生新的有害生物类型，外源基因逃逸对其他植物的造成基因污染，引发潜在生态危害，如产生新的毒性或者过敏原等［32］。因此，应加强转基因植物特异表达的研究，对于尚未完全成熟的成果不应急于应用到生产实际当中，尽可能避免转基因植物对人体与生态环境伤害。

葡萄属植物遗传转化体系已经发展了30年之久，但仍存在很多亟待解决的问题。经过研究人员几十年共同努力，酿酒葡萄‘黑比诺基因组测序已初步完成；与葡萄果实品质相关优良抗病、抗虫、抗寒、抗旱、抗盐碱等基因也被不断发掘［33］；许多栽培品种和砧木品种已建立较为成熟的再生体系；抗病虫和抗毒素等基因的成功转化，初步建立遗传转化体系，葡萄育种工作取得不可小觑的进展。但是，目前葡萄属植物遗传转化效率较低，严重制约了葡萄基因工程的发展。未来，我们应聚焦提高遗传转化效率和简化转化过程两大内容，尽快解决葡萄属植物遗传转化效率低的问题。近年来，葡萄基因工程的研究发展势头正盛，相信在未来会有更多优良品质、抗逆性强的葡萄品种出世，基因工程的研究定能带领葡萄產业走向更光明的未来。

中文致谢

参考文献

［1］ BISSON L F， WATERHOUSE A L， EBELER S E， et al.The present and future of the international wine industry［J］. Nature， 2002， 418（6898）： 696-699.

［2］ 贺普超，罗国光.葡萄学［M］.中国农业出版社， 1999.

［3］ VIDAL JR， GOMEZ C， CUTANDA MC， et al. Use of gene transfer technology for functional studies in grapevine［J］. Australian Journal of Grape and Wine Research，2010（16）：138-151.

［4］ MULLINS MG， TANG FA &FACCIOTTI D.Agrobacterium-mediated genetic transformation of grapevines： transgenic plants of Vitis rupestris Scheele and buds of Vitis vinifera L.［J］.Nature Biotechnology，1990（8）：1041-1045.

［5］ SCORZA R， CORDTS JM， GRAY DJ， et al. Producing Transgenic ‘Thompson Seedless grape （Vitis vinifera L.） plants［J］. Journal of the American Society for Horticultural Science， 1996， 121（4）：616-619.

［6］ FRANKS TRICIA， HE DING GANG， THOMAS MARK. Regeneration of transgenic shape Vitis vinifera L. Sultana plants： genotypic and phenotypic analysis［J］. Molecular Breeding， 1998， 4（4） ： 321-333.

［7］ 周鹏，王跃进，贺普超.人胰岛素样生长因子-I基因转化葡萄的研究［J］.热带作物学报，2002（1）：54-61.

［8］ 孙仲序，陈受宜，王建设，等.农杆菌介导BADH基因转化葡萄的研究［J］.果树学报，2003（2）：89-92.

［9］ 鲍睿.中国野生毛葡萄VqRSGT基因的遗传转化与功能研究［D］.西北农林科技大学，2017.

［10］ 张莹.基于‘霞多丽葡萄花蕾与种子的体细胞胚再生体系建立及农杆菌介导基因转化的研究［D］.宁夏大学，2021.

［11］ 刘昱.葡萄体细胞胚的诱导及VvACS1基因对葡萄的遗传转化［D］.河南农业大学，2018.

［12］ MAURO M C， TOUTAINA S， WALTERB B. High efficiency regeneration of grapevine plants transformed with the GFLV coat protein gene［J］.Plant Science， 1995，112（1）：97-106.

［13］ DHEKNEY S A， LI Z T， DUTT M， et al. Agrobacterium-mediated transformation of embryogenic cultures and plant regeneration in Vitis rotundifolia Michx. （Muscadine grape）［J］.Plant Cell Rep.， 2008，27（5）： 865-872.

［14］ FAN C H， PU N， WANG X， et al. Agrobacterium-mediated genetic transformation of grapevine （Vitis vinifera L.） with a novel stilbene synthase gene from Chinese wild Vitis pseudoreticulata［J］.Plant Cell Tiss. Org.，2008， 92（2）： 197-206.

［15］ 李云，馮慧，田砚亭.葡萄再生系统研究进展［J］.生物技术通报，2000（2）：28-31.

［16］ 刘昱，付濛濛，安栋梁，等.葡萄体细胞胚发生及遗传转化体系研究进展［J］.分子植物育种，2018，16（18）：6068-6079.

［17］ 谭超.葡萄再生体系建立的影响因素［J］.农家之友（理论版），2011（1）：26-27.

［18］ SANFORD J C，KLEIN T M，WOLF E D， et al. Delivery of substances into cells and tissues using a particle bombardment process［J］.Particul Sci Technol，1987（5）：27-37.

［19］ HEBERTD.Optimization of biolistic transformation of embryogenicgrape cell suspensions［J］.Plant Cell Rep，1993（12）：585-589.

［20］ SCORZA R，CORDTS JM，RAMMING DM， et al. Transformation of grape （Vitis vinifera L.） zygotic derived somatic embryos and rsgeneration of transgenic plants［J］.Plant Cell Reports，1995，14（9）：589-592.

［21］ 赵亭亭.山葡萄高效遗传转化愈伤体系的建立［D］.中国科学院武汉植物园，2017.

［22］ IOCCO P，FRANKS T， THOMAS M R.Genetic transformation of major wine grape cultivars of Vitis Vinifera L.［J］. Transgenic Research，2002，10（2）：105-112.

［23］ TAO J， LING L. Genetic transformation of Torenia fournieri L.mediated by Agrobaterium rhizogenes［J］. South African Journal of Botany，2006（72）：211-216.

［24］ BOUAMAMA B， MLIKI A， GHORBEL A. Efficiency of coupling biolistic and Agrobacterium in genetic transformation of Tunisian autochthonous grapes［J］. Agricoltura Mediterranea，2000，130（3-4）：223-227.

［25］ BIDNEY D， SCELONGE C， M ART ICH J， et al. Microprojectile bombardment of plant tissues increases transformation frequency by Agrobacterium tumef aciens［J］.Plant Mol.Biol.，1992（18）：301-314.

［26］ KIKKERT J， THOMAS M， REISCH B. Grapevine genetic engineering［J］. Molecular Biology & Biotechnology of the Grapevine.2001：393-410.

［27］ WANG Q， PING L， HANANIA U， et al. Improvement of Agrobacterium-mediated transformation efficiency and transgenic plant regeneration of Vitis vinifera L. by optimizing selection regimes and utilizing cryopreserved cell suspensions［J］. Plant Science， 2005， 168（2）：565-571.

［28］ PENA L， CERVERA M， JUAREZ J，et al. Agrobacterium-mediated tranformation of sweet orange and regeneration of transgenic plants［J］.Plant Cell Rep，1995（14）：616-619.

［29］ 张莹，雅蓉，徐伟荣，等.褪黑素在霞多丽葡萄种子体细胞胚诱导发生中的作用［J］.果树学报，2021，38（6）：922-933.

［30］ 雅蓉，徐伟荣，张莹，等.褪黑素对‘无核白葡萄体细胞胚的诱导作用［J］.园艺学报，2020，47（5）：953-962.

［31］ 张丽，王敬东，宋玉霞.农杆菌介导的葡萄转化研究进展［J］.生物技术通报，2012（2）：14-19.

［32］ 董志刚，马小河，赵旗峰，等.葡萄遗传转化体系研究进展与展望［J］.山西农业科学，2013，41（11）：1264-1269.

［33］ SCORZA R，CORDTS JM，RAMMING DM， et al. Transformation of grape （Vitis vinifera L.） zygotic derived somatic embryos and rsgeneration of transgenic plants［J］.Plant Cell Reports，1995，14（9）：589-592.

［36］ 庄智敏. 农杆菌介导AtNHX1基因转化葡萄砧木99R的研究［D］.南京农业大学，2006.

［37］ 杨丽娜，刘捷，庄智敏，等.根癌农杆菌介导Barnase基因转化‘美人指葡萄的研究［J］.南京农业大学学报，2009，32（1）：31-35.

［38］ 赵凤霞，王正平，高相彬，等.农杆菌介导的葡萄胚性与非胚性愈伤组织遗传转化过程中胁迫响应基因的表达（英文）［J］.果树学报，2011，28（6）：964-971，1149.

［39］ 梁宏伟，陈发菊，王玉兵，等.根癌农杆菌介导hGLP1基因转化摩尔多瓦葡萄的研究［J］.西北农业学报，2013，22（2）：131-135.

［40］ 张修铭.中国野生华东葡萄VpCN基因转化欧洲葡萄无核白的研究［D］.西北农林科技大学，2017.

［41］ 贾慧.葡萄抗白粉病VvBAK1和VvLecRK1 CRISPR/Cas9载体构建及转化葡萄的研究［D］.西北农林科技大学，2019.

［42］ STAMP J A， COLBY S M， Meredith C P. Improved shoot organogenesis from leaves of grape［J］.Journal of the American Society for Horticultural Science，1990，115（6）：1038-1042.

［43］ 常新，梁晋军，刘振华，等.黑香蕉葡萄不同器官发生途径再生体系的优化［J］.中国农业大学学报，2018，23（9）：43-52.

［44］ 苗卫东，井朋伟，王萌，等.克瑞森无核葡萄不同器官的离体培养［J］.山东农业科学，2021，53（7）：27-33.

［45］ 张美玲，杨国顺，石雪晖，等.红宝石无核和SO4单芽茎段的增殖与成苗培养［J］.中外葡萄与葡萄酒，2010（7）：28-30+30+33.

［46］ 陶建敏，庄智敏，章镇，等.美人指葡萄不定芽离体诱导再生植株的研究［J］.果树学报，2005（5）：551-553，599.

［47］ CLOG E， BASS P， WALTER B. Plant regeneration by organogenesis in Vitis， rootstock species.［J］.Plant Cell Reports， 1990，8（12）：726-728.

［48］ 胡文斌，张少飞，孙娜.陇南红提葡萄茎段组织培养研究［J］.陕西林业科技，2018，46（1）：6-9.

［49］ 李云，冯慧，田砚亭.‘红地球葡萄叶片、叶柄不定芽再生体系的建立［J］.园艺学报，2002（1）：60-62.

［50］ 王华，卢江，马春花，等.酿酒葡萄“梅尔诺”再生系统建立的研究［J］.西北植物学报，2005（5）：858-863.

［51］ SALUNKHE C K， RAO P S， MHATRE M. Induction of somatic embryogenesis and plantlets in tendrils of Vitisvinifera L.［J］.Plant Cell Reports， 1997，17（1）：65-67.

［52］ 金万梅，董静，闫爱玲，等.葡萄器官离体再生和遗传转化体系的建立［J］.园艺学报，2008（1）：27-32.

［53］ 張克忠，鲍雪珍，白永延，等.苏云金杆菌内毒素蛋白基因转入葡萄胚性愈伤组织细胞及转基因植株再生的研究［J］.试验生物学报，1997，30（3）：303-308.

［54］ 权冬玲，常永义.葡萄不同器官直接再生不定芽研究［J］.甘肃农业大学学报，2005（2）：173-177.

［55］ 王宁，宗成文，汤晓艳，等.山葡萄“左优红”离体器官再生不定芽的研究［J］.辽宁林业科技，2011（1）：27-29.

［56］ 代玲敏，周起，杨亚州，等.欧洲葡萄‘霞多丽体细胞胚再生途径建立与转化华东葡萄芪合成酶基因［A］.中国园艺学会.中国园艺学会2015年学术年会论文摘要集［C］.中国园艺学会：中国园艺学会，2015.

［57］ 李国树，邱璐，徐成东，等.葡萄组织培养快速繁殖体系研究［J］.北方园艺，2011（9）：134-136.

［58］ 宾宇波，沙海峰，任建武，等.百花山葡萄组织培养和快速繁殖［J］.西北林学院学报，2013，28（6）：99-102.

［59］ MAILLOT PASCALE， DEGLENE-BENBRAHIM LAURENCE， WALTER BRENAID. Efficient somatic embryogenesis from meristematic explants in grapevine （Vitis vinifera L.） cv. Chardonnay： an improved protocol［J］.Trees， 2016，30（4）： 1377-1387.

收稿日期：2023-05-10中文收稿日期

基金项目：基于酿酒葡萄种子受体材料的遗传转化体系建立项目（G2021107490021）。中文作者简介

第一作者简介：张天玥（2001-），女，本科在读，主要从事葡萄组织培养及栽培技术研究。中文作者简介