农杆菌介导的旱稻遗传转化主要影响因素

李朝炜+冯丹+翟会青+刘梅+魏景芳

摘要：以旱稻品种鲲旱1号为材料，对农杆菌介导的遗传转化中愈伤组织的诱导、筛选、分化等的影响因素进行了研究。将PPA抗虫基因和bar抗性基因成功导入旱稻愈伤组织，经过筛选和分化最终获得了抗性植株。结果表明，改良的NB培养基适合于旱稻愈伤组织的诱导；当农杆菌浓度在OD600 nm为0.2～0.3，侵染时间为20 min时，转化效果最好；用40 mg/L的PPT筛选30 d后，可以获得抗性愈伤组织；将已筛选的抗性愈伤组织在预分化培养基上培养5～7 d能有效提高分化率。

关键词：旱稻；农杆菌；遗传转化

中图分类号：Q789 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）15-3482-05

Main Factors Affecting Upland Rice Transformation Mediated by

Agrobacterium tumefacien

LI Zhao-wei，FENG Dan，ZHAI Hui-qing，LIU Mei，WEI Jing-fang

（Department of Biological Science and Engineering，Hebei University of Science and Technology，Shijiazhuang 050018，China）

Abstract： Using the seeds of upland rice Kunhan No.1 as the experimental materials， the effects of main factors including induction of calli， selection， and regeneration on the upland rice transformation frequency were investigated. The PPA gene and bar resistance gene were successfully transformed into upland rice calli. The resistant plants were obtained by screening and differentiation. The results showed that the improved NB medium was the optimal medium for inducing upland rice calli. The suitable concentration of the Agrobacterium was between 0.2 and 0.3. The incursion time was 20 min. Resistant calli can be obtained after being screened in the selective medium with 40 mg/L PPT for 30 days. The resistant calli were pre-differentiated 5～7 days before differentiation. The differentiation frequency of calli could be increased.

Key words： upland rice； Agrobacterium tumefacien； genetic transformation

收稿日期：2014-03-20

基金项目：国家转基因生物新品种培育科技重大专项（2011ZX08001-003）

作者简介：李朝炜（1979-），女，河北衡水人，讲师，博士，从事植物分子生物学和基因工程研究，（电话）0311-81668495（电子信箱）

lizhaowei79@163.com。

旱稻，也被称作陆稻，是水稻的变异型。其耐旱性强，适于旱地、坡地等干旱生态环境下种植。其在形态、生理等方面与水稻有不少的差别，一般在干旱缺水的生长状况下表现明显。据统计，每生产500 kg旱稻稻谷，用水量则仅为水稻用水量的10%～20%。缺水是我国农业生产所面临的严峻考验之一[1]。此外，我国水资源时空分布不均匀，南方水资源较为充沛，而北方水资源不到全国总量的20%。特别是进入7月中下旬，大部分地区降雨开始明显减少，而水稻此时处于抽穗灌浆的关键时期，用水需求量很大，同时现有选育和推广的稻作品种普遍抗旱性不足，致使很多地区缺水的现状已成为影响水稻产量的重要原因之一。因此大力推广适于旱地种植的栽培稻即旱稻栽培种，能节约大量的农业用水，充分利用土地资源，降低生产成本，提高经济效益[2]。此外，旱稻采用直播种植的方式，省去了育秧、插秧等环节，大大减轻稻农的田间劳动量，非常适用于目前国内农业劳动力短缺的现状。

大力发展旱稻还可为培育优质稻类新品种打下基础，而其关键是进行品种选育，获得抗逆、优质、高产的旱稻品种。通过农杆菌介导法这一基因工程手段进行改良是稻类作物遗传转化的首选方式[3-8]。近年来，针对稻类作物遗传转化体系的研究绝大多数是以水稻为研究材料，而关于旱稻的研究报道则主要集中在杂交育种、抗旱性测定、生理指标测定、特定基因的标记定位、遗传多样性分析等方面[9，10]。由于两者品种间的明显遗传差距，在愈伤组织诱导、抗性筛选、分化再生等方面的具体培养条件差别较大[11-13]。目前已报道的旱稻遗传效率较低，且不同品种间转化条件差别较大。本研究以高耐旱、大穗大粒型粳旱稻品种鲲旱1号的成熟种子为材料，研究农杆菌介导法转化旱稻的体系中各个关键技术环节，为建立稳定高效的旱稻转化体系，进一步获得具有抗逆性强的高产优质转基因旱稻奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 旱稻材料 旱稻品种鲲旱1号成熟胚诱导的胚性愈伤组织为受体材料。

1.1.2 质粒及菌株 pCAMBIA3301由中国农业科学院生物技术研究所提供。随后将来自于掌叶半夏的凝集素基因PPA构建入该表达载体，赋予转基因旱稻抗虫的能力。筛选标记基因为bar（Biolaphos resistance gene），编码膦丝菌素乙酰转移酶（Phosphinothricin acetyl transferase，PAT），可对除草剂草丁膦的有效成分膦丝菌素（PPT）产生抗性。农杆菌菌株为AGL-1，由中国农业科学院生物技术研究所提供。

1.1.3 培养基 研究采用NB培养基（N6大量元素、B5微量元素、有机元素、铁盐）及MS培养基作为基本培养基，添加一定浓度的激素及适量谷氨酰胺、水解酪蛋白和麦芽糖等成分。具体培养基成分见表1。

1.2 方法

1.2.1 种子的灭菌 选取适量子粒饱满、干净无霉变的旱稻种子，脱去颖壳，放置在指形管中，先用清水洗两遍，在超净台中加入适量75%的乙醇振荡消毒1 min，然后弃去液体，再加入适量的0.1%升汞或者有效氯为5%的次氯酸钠溶液和几滴吐温20。灭菌两次，每次20 min，期间不断振荡。随后弃去液体，用无菌水清洗5次，在三角瓶中浸泡20～30 min，再用无菌水清洗3～5次。将种子捞出，置于放有无菌滤纸的培养皿中吸干水分。

1.2.2 愈伤组织的诱导及继代 待种子基本干燥之后，用灭菌的小勺或镊子将种子均匀分布在不同成分的诱导培养基上，每一个培养皿放置15～20粒，用封口膜将培养皿封好，置于28 ℃培养箱中暗培养。培养3～4 d后可见愈伤组织明显形成，培养至7～10 d时，愈伤组织长至绿豆粒大小，此时将长出的芽切去，再继续培养20～22 d统计出愈率。

诱导愈伤暗培养约30 d左右，挑选颜色淡黄、质地致密，并且愈伤组织表面散落出直径约1～2 mm的球形愈伤团块，将其继代到新鲜诱导培养基上，于28 ℃暗培养5～7 d。

1.2.3 侵染及共培养 取适量超低温保存的带有目的基因的农杆菌菌种涂布在YEP固体培养基上，28 ℃下暗培养48 h。将培养基表面长出的农杆菌轻轻刮下放入50 mL AAM液体培养基中，于28 ℃，200 r/min振荡培养2～3 h。在继代培养基中挑选出直径为2～3 mm的状态良好、松脆圆润的愈伤组织，放入灭菌锥形瓶中，每个锥形瓶大约收集300块。在摇瓶培养后的菌液中逐渐加入新的AAM培养基，调整OD600 nm为0.2～0.3，将菌液倒入收集好愈伤组织的锥形瓶中，室温侵染20 min，期间不时轻摇。弃去菌液，将愈伤组织用无菌滤纸吸干，转移至铺有一层无菌滤纸的共培养培养基上，25 ℃暗培养3 d。

1.2.4 抗性愈伤的筛选 将共培养后的愈伤组织取出置于灭菌培养瓶中，用无菌水洗涤4～5次，每次充分摇动，然后加入含500 mg/L特美汀的NB液体培养基，室温静置10 min。弃去液体，倒入含500 mg/L特美汀与2.0 mg/L 2，4-D的NB液体培养基，封口后室温80 r/min摇瓶培养1 h，弃去液体，将愈伤组织置于带有无菌滤纸的培养皿中吸干水分并放置过夜。再将愈伤组织均匀放置在恢复培养基上，28 ℃暗培养5～7 d（恢复培养基是在NB基本培养基中加入2，4-D 2.0 mg/L）。将经过转化的愈伤组织转移到筛选培养基上，28 ℃暗培养，15 d后继代一次，继续筛选培养15-20 d。

1.2.5 预分化及分化 将经过筛选后新长出的抗性愈伤组织转接到预分化培养基上，28 ℃暗培养5～7 d。随后将其转入分化培养基，28 ℃暗培养3 d后移至光下，28 ℃培养15 d后挑选新生的幼小嫩芽移至新的分化培养基，继续培养15 d左右。

1.2.6 壮苗及生根 待新生幼苗长至2 cm左右时，移至生根培养基中，28 ℃光照培养3～4周，待诱导出根并且幼苗长至7～10 cm时，从培养基中取出，洗净根部沾染的培养基，移至育秧盘中（营养土与蛭石按照3∶1混合），继续培养10 d左右后即可移入温室或大田。

1.2.7 数据分析

出愈率=（产生愈伤组织的种子个数/接种的种子个数）×100%

抗性愈伤率=（抗性愈伤数/供试愈伤数）×100%

分化率=（再生植株数/抗性愈伤数）×100%

再生率=（再生植株数/供试愈伤数）×100%

转化率=（阳性转基因苗数/供试愈伤数）×100%

1.2.8 转基因旱稻植株的分子水平鉴定 采用CTAB法从抗性再生旱稻幼苗的新鲜叶片中提取基因组DNA，凝集素基因PPA正向引物为 5′-ATCTCAGGAACAGCGACTTCGAC-3′，反向引物为 5′-TGATGATGAGCTCGCCCTTGTG-3′，扩增的目的片段为 510 bp。PCR反应采用20 μL体系，具体为： 10×缓冲液2 μL，两种引物各1 μL（终浓度为 1 pmol/L），基因组DNA 1 μL，2.5 mmol/L的dNTP1.6 μL（终浓度 200 μmol/L），Taq酶0.2 μL（1U），用无菌超纯水补足体积至20 μL。PCR程序为：96 ℃预变性3 min；94 ℃变性40 s，50 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环；72 ℃延伸10 min。PCR反应结束后，产物用1%琼脂糖凝胶80 V电泳进行检测。

2 结果与分析

2.1 不同消毒剂对旱稻种子灭菌效果的影响

升汞与次氯酸钠均是植物组织培养常用的消毒剂。本研究采用0.1%升汞和5%次氯酸钠分别进行200粒种子的消毒，随后接种于以NB培养基为基础的愈伤诱导培养基中，一周后比较污染率和出愈率。结果显示在消毒时间为10、20 min时，两者处理后的种子污染率及出愈率差别不大。处理时间超过30 min时均能达到较好的消毒效果（表2）。但随着处理时间的延长，升汞对植物组织的毒害作用逐渐增大，尤其是消毒时间达到30 min以上时，种子胚部明显变黑，出愈率显著降低。加之升汞粉末经吸入、食入或者经皮肤吸收均对人体有毒害作用，因此本研究采用次氯酸钠处理40 min作为灭菌条件。

2.2 不同培养基成分对旱稻愈伤组织诱导效率的影响

本研究在旱稻愈伤组织培养阶段采用NB和MS培养基作为基础并加以优化。结果显示，这两种培养基均可在5～7 d开始诱导出愈伤组织，但对愈伤组织的诱导效率明显不同，NB培养基的愈伤组织诱导效率明显高于MS培养基，具体见表3。此外，这两种培养基所诱导出的愈伤组织的状态也有所不同。NB培养基上的愈伤组织呈淡黄色，较为整齐，颗粒致密且形态圆润；MS培养基上的愈伤组织颜色较为暗淡，松散易碎，且容易褐化。因此，本研究以NB培养基为基础并进行改良，比较了蔗糖和麦芽糖分别作为碳源以及是否添加脯氨酸时愈伤组织的生长状态。结果显示，当以蔗糖为碳源并添加脯氨酸时，诱导出的愈伤组织颜色较深且容易褐化。当去掉脯氨酸并将碳源换为麦芽糖时，愈伤组织为淡黄色且状态良好。

另外，还分别进行了2，4-D终浓度分别为2 、3 和4 mg/L的试验，结果显示随着培养基中2，4-D浓度的增加，愈伤组织的诱导效率略有上升但差异并不大，但较高浓度的2，4-D会使愈伤组织变得较为细碎，不适于后续的转化试验，因此在本研究中2，4-D的使用浓度为2 mg/L。

2.3 PPT对旱稻抗性愈伤组织的筛选条件

据以往文献报道，粳稻的PPT筛选浓度较籼稻略高，一般籼稻的筛选浓度多为10～20 mg/L，而粳稻多为20～30 mg/L[5，14-16]。本研究所用的旱稻鲲旱1号为粳稻和爪哇稻远缘杂交获得，因此选择20、30、40、50 mg/L等几个浓度进行旱稻愈伤组织的除草剂耐受程度试验，以确定适宜的PPT选择浓度。

每种浓度分别接入100块愈伤组织，27 ℃暗培养3～4周后统计愈伤组织的生长及存活状况，之后将存活愈伤组织转接入分化培养基，27 ℃光照条件下培养3周后统计能够形成绿点的愈伤数，据此计算分化率。不同浓度PPT处理时愈伤组织的生长情况如表4。表4结果显示，在不同浓度PPT处理时，愈伤组织生长速度均明显减慢。PPT为30 mg/L和40 mg/L的培养基上，可明显抑制未转化愈伤组织的生长，存活率分别为29%和23%；PPT为50 mg/L的培养基上，愈伤组织生长状态很差，绝大多数发生褐化死亡。结合分化率的数据，将选择培养基中的PPT浓度设定为40 mg/L。

2.4 农杆菌的菌液浓度与侵染时间对旱稻抗性愈伤率和再生率的影响

研究表明，对于选用不同的受体品种和不同的农杆菌菌株，最适菌液浓度和侵染时间会有所差别。在本研究中对这两个因素分别进行了摸索。首先采用相同的侵染时间，OD600 nm分别设定为0.1、0.2、0.3、0.4。随后在相同的OD600 nm条件下，将侵染时间分别设定为10、20、30 min。每组试验选取150块愈伤组织，分别计算抗性愈伤率及分化率。具体结果见表5。

由表5可见， 在相同菌液浓度的条件下， 随着侵染时间的延长， 抗性愈伤率逐渐升高。但当OD600 nm为0.4、处理时间达到20 min以及OD600 nm为0.3、处理时间达到30 min时，愈伤组织被过度侵染，在后续筛选阶段残留的农杆菌不易清除，极易造成污染导致无法统计数据。此外，当侵染时间达到40 min时，由于时间较长，对愈伤组织造成伤害使之活力下降，并且在共培养结束之后也不易抑菌，无法进行后续试验，因此没有作出相关数据的统计。

当OD600 nm为0.2或0.3，侵染时间为20 min时，抗性愈伤率及再生率较高且差别不大。而当OD600 nm为0.2，侵染30min时虽然抗性愈伤率较高，但由于侵染时间长对愈伤组织造成伤害较大，再生率并不高。因此选定OD600 nm为0.2～0.3，侵染时间20 min作为最适试验条件。

2.5 预分化培养对旱稻分化率的影响

研究结果（表6）表明，将筛选得到的抗性愈伤组织在黑暗条件下进行5～7 d的预分化培养，再将其转接至分化培养基。经过预分化的愈伤组织颜色为乳白色且富有光泽，在分化培养基上生长较快，状态良好，分化率较高。而未经预分化的愈伤组织则颜色发黄且暗淡，生长缓慢，分化率较低且易褐化。主要原因在于预分化培养基中加入的脱落酸（ABA）具有促进植物细胞吸收营养和协调代谢的能力[17]，能够调整愈伤组织的生理状态，促进胚性愈伤组织发生，因此有利于提高分化率。

2.6 转基因植物的PCR检测分析

对农杆菌侵染转化鲲旱1号获得的T0代转化植株进行了目的基因PPA的PCR检测。大多数转化植株中可特异地扩增出大小510 bp的目的基因片段，与阳性对照扩增结果完全相同（图1）。同时以未转化的植株提取基因组DNA作为对照，未扩增出目的片段。本研究共选取了300个状态良好的愈伤团块进行农杆菌侵染转化，经筛选获得203块抗性愈伤，经分化得到46块独立的T0代转化单株，经PCR检测鉴定其中的38株含有目的基因PPA，转化率为12.7%。

3 讨论

3.1 旱稻愈伤组织的诱导条件

不同稻类的基因型差异是影响其转化效率的重要因素[5]，究其根本，主要是受到愈伤组织的诱导效果以及分化与再生的难易程度的影响。在进行稻类基因转化研究时，因其成熟种子取材不受季节限制、出愈率较高，且诱导出的胚性愈伤组织较易于分化再生，因此被作为愈伤组织的常用外植体来源。为获得状态良好的愈伤组织，本研究针对鲲旱1号胚性愈伤组织的适宜诱导培养基进行了摸索。结果显示其在MS和NB培养基上均可形成愈伤组织，但以NB培养基为基础进行诱导时的出愈率及状态要好于MS培养基。

有研究显示在诱导培养基中添加适量浓度的脯氨酸能够增强愈伤组织的代谢活力，促进愈伤组织的生长[18，19]，但多应用于植物花药和幼穗组织的愈伤组织诱导培养，且其具体作用原理尚不十分明确。而本研究发现当NB及MS培养基中添加一定浓度脯氨酸时，旱稻诱导形成的愈伤组织为土黄色，质地细碎干瘪且容易褐化，而去掉脯氨酸后愈伤组织为淡黄色，颗粒致密，生长状况良好，适于后续的遗传转化。

3.2 PPT浓度对抗性愈伤组织筛选的影响

本研究所选用的筛选标记基因为bar基因，目前已成功应用于多种重要农作物的遗传转化。因其既可作为标记基因使用，在植物体内的表达产物又可作为非选择性的除草剂，在农业生产中具有实用性，因此涉及的领域日益广泛[5]。不同物种及同一物种的不同组织的PPT筛选使用浓度往往差异较大，多从1～40 mg/L不等[20]。因此，在研究中针对不同的转化体系均应摸索适宜的筛选浓度，对提高转化率具有重要的意义。

试验发现，鲲旱1号对PPT的自然耐受性较高，当培养基中PPT浓度为20 mg/L及更低时，大量非转化的细胞能够存活并分化成苗。当达到30～40 mg/L时，可使大部分非转化细胞死亡，但同时PPT浓度为30 mg/L时仍有一小部分存活的非转化细胞能够分化出苗。结合后续T0代转化植株的PCR鉴定结果，为尽可能的降低假阳性率，以40 mg/L的PPT作为旱稻转化后抗性愈伤组织筛选的浓度较为适宜，阳性率可达到82.6%。

3.3 农杆菌侵染条件对转化效果的影响

采用农杆菌介导法进行植物组织基因转化时，菌液浓度和浸染时间对转化效率的影响非常大[5，21]。一般来讲，较高的菌液浓度或较长的浸染时间可以提高农杆菌对植物组织的附着和侵染程度，但如果浓度过高或时间过长，致使农杆菌过度生长，易对愈伤组织造成伤害，并且会因不能正常脱菌而导致愈伤组织污染和死亡。反之如菌液的浓度太低或浸染的时间太短，所含农杆菌的有效细胞数目太少，或者有效地附着在愈伤团块表面的农杆菌的量不足，都会导致转化频率降低。针对本研究采用的转化体系而言，最适条件为OD600 nm=0.2～0.3，侵染时间为20 min，抗性愈伤率和再生率分别可达到65%和20%以上。

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3.2 PPT浓度对抗性愈伤组织筛选的影响

本研究所选用的筛选标记基因为bar基因，目前已成功应用于多种重要农作物的遗传转化。因其既可作为标记基因使用，在植物体内的表达产物又可作为非选择性的除草剂，在农业生产中具有实用性，因此涉及的领域日益广泛[5]。不同物种及同一物种的不同组织的PPT筛选使用浓度往往差异较大，多从1～40 mg/L不等[20]。因此，在研究中针对不同的转化体系均应摸索适宜的筛选浓度，对提高转化率具有重要的意义。

试验发现，鲲旱1号对PPT的自然耐受性较高，当培养基中PPT浓度为20 mg/L及更低时，大量非转化的细胞能够存活并分化成苗。当达到30～40 mg/L时，可使大部分非转化细胞死亡，但同时PPT浓度为30 mg/L时仍有一小部分存活的非转化细胞能够分化出苗。结合后续T0代转化植株的PCR鉴定结果，为尽可能的降低假阳性率，以40 mg/L的PPT作为旱稻转化后抗性愈伤组织筛选的浓度较为适宜，阳性率可达到82.6%。

3.3 农杆菌侵染条件对转化效果的影响

采用农杆菌介导法进行植物组织基因转化时，菌液浓度和浸染时间对转化效率的影响非常大[5，21]。一般来讲，较高的菌液浓度或较长的浸染时间可以提高农杆菌对植物组织的附着和侵染程度，但如果浓度过高或时间过长，致使农杆菌过度生长，易对愈伤组织造成伤害，并且会因不能正常脱菌而导致愈伤组织污染和死亡。反之如菌液的浓度太低或浸染的时间太短，所含农杆菌的有效细胞数目太少，或者有效地附着在愈伤团块表面的农杆菌的量不足，都会导致转化频率降低。针对本研究采用的转化体系而言，最适条件为OD600 nm=0.2～0.3，侵染时间为20 min，抗性愈伤率和再生率分别可达到65%和20%以上。

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3.2 PPT浓度对抗性愈伤组织筛选的影响

本研究所选用的筛选标记基因为bar基因，目前已成功应用于多种重要农作物的遗传转化。因其既可作为标记基因使用，在植物体内的表达产物又可作为非选择性的除草剂，在农业生产中具有实用性，因此涉及的领域日益广泛[5]。不同物种及同一物种的不同组织的PPT筛选使用浓度往往差异较大，多从1～40 mg/L不等[20]。因此，在研究中针对不同的转化体系均应摸索适宜的筛选浓度，对提高转化率具有重要的意义。

试验发现，鲲旱1号对PPT的自然耐受性较高，当培养基中PPT浓度为20 mg/L及更低时，大量非转化的细胞能够存活并分化成苗。当达到30～40 mg/L时，可使大部分非转化细胞死亡，但同时PPT浓度为30 mg/L时仍有一小部分存活的非转化细胞能够分化出苗。结合后续T0代转化植株的PCR鉴定结果，为尽可能的降低假阳性率，以40 mg/L的PPT作为旱稻转化后抗性愈伤组织筛选的浓度较为适宜，阳性率可达到82.6%。

3.3 农杆菌侵染条件对转化效果的影响

采用农杆菌介导法进行植物组织基因转化时，菌液浓度和浸染时间对转化效率的影响非常大[5，21]。一般来讲，较高的菌液浓度或较长的浸染时间可以提高农杆菌对植物组织的附着和侵染程度，但如果浓度过高或时间过长，致使农杆菌过度生长，易对愈伤组织造成伤害，并且会因不能正常脱菌而导致愈伤组织污染和死亡。反之如菌液的浓度太低或浸染的时间太短，所含农杆菌的有效细胞数目太少，或者有效地附着在愈伤团块表面的农杆菌的量不足，都会导致转化频率降低。针对本研究采用的转化体系而言，最适条件为OD600 nm=0.2～0.3，侵染时间为20 min，抗性愈伤率和再生率分别可达到65%和20%以上。

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