基于PI3K/AKT 信号通路探讨汉黄芩素对宫颈癌HeLa 细胞移植瘤抑制作用影响

钱云英，钱桂英，顾伟群，倪海燕，蔡奚梅

常熟市中医院妇产科，江苏常熟 215500

宫颈癌是妇科常见的恶性肿瘤，随着有效的宫颈防癌筛查和人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)疫苗逐渐推广普及，目前宫颈癌总体发病率有所下降，但出现了发病年轻化的趋势[1-2]。全球每年约有50 万人被诊断为宫颈癌，约有30 万人因此丧生[3]，急需寻求新型有效的抗宫颈癌药物。

黄芩属于唇形科植物，具有清热、缓急止痛之功效，其主要药理作用为抗菌、抗病毒、抗肿瘤等[4]。研究结果表明，黄芩的提取物汉黄芩素能通过特异性诱导子宫颈癌细胞发生凋亡[5]，但相关分子机制有待进一步研究，且缺少相关的体内实验。因此利用宫颈癌动物模型，研究汉黄芩素对宫颈癌的作用具有重要意义。BALB/c 裸小鼠中T 淋巴细胞缺陷，因异体组织诱导的排斥反应较少发生。此外，BALB/c 裸小鼠价格便宜，是建立宫颈癌模型理想的实验动物[6]。常熟市中医院于2018年1 月—2020年12 月选取50 只BALB/c 裸鼠作为研究对象，以建立人宫颈癌模型,探讨汉黄芩素对裸鼠人宫颈癌模型肿瘤生长的影响，并探讨汉黄芩素对PI3K/AKT 信号通路的影响。希望随着本研究的不断深入，对黄芩在预防宫颈癌方面的作用机理进行初步的探索，为进一步研究打下基础。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

50 只4 周龄SPF 级(BALB/c)裸小鼠，体质量150～158 g，雌雄不限，健康状况良好，购自南京中医药大学动物实验中心，许可证号：NO.201911910。裸鼠饲养于SPF 级饲养场所,饮用的灭菌蒸馏水、辐照饲料均购自南京中医药大学动物实验中心。人宫颈癌细胞株购自北京协和医科大学细胞中心。环磷酰胺(浓度2.5 mg/mL)（国药准字H22026738）。游标卡尺购自上海精密仪器仪表有限公司，电子天平购自赛多利斯科学仪器(北京)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 汉黄芩素溶液制备 汉黄芩素（含量HPLC＞98%）由江苏省肿瘤发生与干预重点实验室提供，用DMSO 配成0.125 mol/L，-20℃避光保存，用前调至所需浓度。

1.2.2 细胞冻存 取对数生长期细胞，精胰酶消化后加入适量含10% 血清的完全培养基和5%～10%DMSO 的冻存液，借助吸管制作细胞悬液并在冻存管中放入1 mL 细胞，置入液氮罐内。

1.2.3 细胞复苏 把液氮罐内放置的冻存管取出，快速放置在温度37℃的温水中融化60 s，培养基稀释，待体积增大原来的10 倍，多数细胞贴壁，把含冻存液的培养基进行合理吸取并更换完全培养基。

1.2.4 裸鼠移植瘤模型建立与分组 将100 µL 的Hela 细胞悬液分别注射入每只裸鼠左侧腋窝中部外侧皮下，注射Hela 细胞悬液8 d 后裸鼠皮下均出现移植瘤，16 d 后瘤体直径5～8 mm，表明宫颈癌小鼠造模成功。将造模成功的50 只裸鼠随机平均分为5 组：①模型对照组，不做特殊处理；②阳性对照组，腹腔注射25 mg/kg 环磷酰胺；③小剂量组，灌胃给予25 mg/kg 汉黄芩素；④中剂量组，灌胃给予50 mg/kg 汉黄芩素；⑤高剂量组，灌胃给予100 mg/kg 汉黄芩素。灌胃给药1 次/d，连续2 周。

1.3 观察指标

①计算肿瘤生长抑制率。最后一次给药24 h后，处死各组小鼠，取出皮下肿瘤组织，称取瘤体质量、体积，并计算肿瘤抑制率：肿瘤体积=（长径×短径2）/2（mm3）；肿瘤抑制率=（模型对照组肿瘤质量-处理组肿瘤质量）/模型对照组肿瘤质量×100%。

②计算脏体指数。处死小鼠后取出胸腺和脾脏，对肿瘤进行称重，合理计算小鼠脏体指数，以胸腺质量、脾脏质量与小鼠10 倍质量的比值计算胸腺指数、脾脏指数即可。

③观察小鼠肿瘤组织病理损伤。将肿瘤组织平均分为两部分,保存于-80℃冰箱。取一份用10%甲醛溶液固定，使用石蜡包埋并进行切片，利用苏木精-伊红(HE)染色后观察组织学形态。

④免疫印迹法检测PI3K、AKT 及p-AKT。采用匀浆法对瘤体组织蛋白进行提取，采用二喹啉酸法检测蛋白量。蛋白液体内混入适量上样缓冲液，置于100℃环境中进行热变，聚丙烯酰胺凝胶电泳并转膜处理，漂洗目的膜3 次，每次5 min，最后孵育目的一抗（GAPDH、PI3K、AKT、p-AKT）4℃摇床过夜，值得注意的是一抗稀释比例控制在1：1000。第二天，孵育二抗1 h，稀释液比例是1：5000，然后把显影液适当加入，采用Bio-Rad 成像系统实施成像处理，并基于Image J 软件，分析蛋白灰度值，计算p-AKT 和AKT 相对蛋白表达量和p-AKT/AKT 比值。相关计算公式如下：p-AKT=p-AKT 蛋白灰 度值/GAPDH 蛋白灰度值；AKT=AKT 蛋白灰度值/GAPDH 蛋白灰度值。

1.4 统计方法

采用SPSS 21.0 统计学软件处理数据，符合正态分布的计量资料以（±s）表示，计数资料用[n（%）]表示，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 汉黄芩素对小鼠肿瘤一般情况影响

大剂量组、中剂量组与小剂量组小鼠的肿瘤质量、肿瘤体积均显著低于模型对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 汉黄芩素对小鼠肿瘤一般情况影响(±s)

表1 汉黄芩素对小鼠肿瘤一般情况影响(±s)

注：与模型对照组相比，*P＜0.05

组别模型对照组阳性对照组小剂量组中剂量组大剂量组肿瘤质量（g）1.35±0.09（0.41±0.04）*（0.92±0.06）*（0.61±0.08）*（0.30±0.05）*肿瘤体积（mm3）2.59±0.12（1.23±0.13）*（1.92±0.08）*（1.53±0.09）*（1.15±0.12）*

2.2 汉黄芩素对小鼠肿瘤生长抑制率影响

阳性对照组、小剂量组、中剂量组、大剂量组的小鼠肿瘤生长抑制率分别为69.63%、31.85%、54.81%及77.78%。与阳性对照组比较，大剂量组小鼠肿瘤生长抑制率较高，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 汉黄芩素对小鼠肿瘤生长抑制率影响（%）

2.3 汉黄芩素对小鼠胸腺及脾脏指数影响

与模型对照组比较，阳性对照组、小剂量组、中剂量和大剂量组小鼠胸腺、脾脏指数升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。与阳性对照组相比，汉黄芩素大剂量组小鼠的胸腺及脾脏指数较高，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表3。

表3 汉黄芩素对宫颈癌荷瘤小鼠免疫器官指数影响[(±s)，mg/g]

表3 汉黄芩素对宫颈癌荷瘤小鼠免疫器官指数影响[(±s)，mg/g]

注：与模型对照组相比，*P＜0.05

组别模型对照组阳性对照组小剂量组中剂量组大剂量组胸腺2.94±0.12（9.63±0.12）*（4.25±0.09）*（7.21±0.11）*（11.21±0.13）*脾脏10.41±1.21（16.59±1.54）*（12.63±1.30）*（13.95±1.22）*（18.53±1.06）*

2.4 汉黄芩素对小鼠肿瘤组织病理学表现影响

模型对照组的肿瘤组织中癌细胞染色正常、结构较完整。阳性对照组、小剂量组、中剂量、大剂量组出现明显的癌细胞坏死，阳性对照组与汉黄芩素大剂量组的癌细胞坏死程度相近，见图1。

图1 各组小鼠肿瘤组织病理学表现（HE 染色，200×）

2.5 各组小鼠肿瘤组织中PI3K、AKT 及p-AKT分布

与模型对照组相比，阳性对照组、小剂量组、中剂量组、大剂量组癌组织中PI3K、AKT 、p-AKT 表达明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。大剂量组中PI3K、AKT 和p-AKT 表达量与阳性对照组接近，见图2。

图2 各组PI3K、AKT 及p-AKT 蛋白表达水平

3 讨论

宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤，近年来，其发病率呈年轻化趋势，目前对于宫颈癌的诊断和筛查并不困难，但缺乏有效的中西医干预治疗措施[7-8]。在中医学领域中，宫颈癌归入“崩漏”“瘕聚”等范畴，女性脏腑气血调节差，湿毒堆积，损伤冲任二脉，最终诱发崩漏，所以中医医师建议扶正祛邪为治疗原则，扶正是改善患者免疫状态，祛邪是指抑制肿瘤生长,两者有效结合达到抗癌效果[9]。本研究证实汉黄芩素在一定程度上抑制机体宫颈癌Hela 细胞移植瘤的恶性生长，促使瘤体快速凋亡，延长病人生存时间，在宫颈癌治疗中的优势突出。

植物药对机体的不良反应少，抗药性小，是抗肿瘤药物的优选。汉黄芩素是黄芩的有效成分之一，可以增强肿瘤细胞的敏感性；汉黄芩素是从黄芩中提取的一种黄体酮类化合物，其临床应用广泛,效果显著，能起到显著的抗肿瘤作用[10]。有关研究表明，汉黄芩素以剂量依赖方式抑制Hela 细胞，其作用效果明显。汉黄芩素能够特异性诱导肿瘤细胞凋亡，增强其对药物的敏感性。汉黄芩素可通过抑制E6、E7 蛋白的表达来诱导HPV(+)人宫颈癌细胞的凋亡;还可以通过调控RET，PRET、GDNFRa1、CX3CR1 等蛋白的表达抑制人宫颈癌细胞生长[11-12]。本研究从PI3K/AKT 信号通路的角度来探讨汉黄芩素对宫颈癌Hela 细胞移植瘤抑制作用的影响，结果显示：汉黄芩素可显著抑制宫颈癌Hela细胞移植瘤的生长，其作用机制可能与汉黄芩素抑制PI3K/AKT 信号通路有关。

PI3K 属于二聚体物质，主要构成是调节亚基P85、催化亚基p110，结合人体生长因子受体后，会导致AKt 蛋白结构产生变化，快速活化AKt 蛋白，因自身磷酸化作用可以对人体下游底物产生激活或者抑制作用，比如凋亡相关蛋白Bad、Caspase9 活性，增值、分化、凋亡乃至迁移人体调节细胞表型[13-15]。PI3K/ AKT 是细胞生长发育过程中一条重要的信号通路,在细胞内参与增殖、凋亡,糖代谢及炎症 反应等。一些细胞因子、生长因子激活PI3K后活化Akt 参与一系列的生物调控。有研究表明，PI3K/AKT 通路异常激活与宫颈癌发生、增殖、侵袭、迁移密切相关[16-18]。因此，能有效抑制PI3K/AKT 通路是治疗宫颈癌的重要途径。本研究采用建立BALB/c 宫颈癌小鼠模型,研究结果发现：汉黄芩素小剂量组、中剂量组及大剂量组均可以明显降低小鼠肿瘤质量及肿瘤体积，并且在小鼠肿瘤组织病理学切片HE 染色中可以明显观察到小鼠肿瘤组织中有不同程度的肿瘤细胞坏死。与模型对照组相比，汉黄芩素小剂量组、中剂量组和大剂量组的肿瘤组织中PI3K、AKT、p-AKT 表达量显著减少，提示汉黄芩素可通过抑制PI3K/AKT 信号通路来调控宫颈癌Hela 细胞移植瘤的生长，诱导细胞凋亡的发生，此作用可能与汉黄芩素具有抗肿瘤作用的机制有关。

综上所述，汉黄芩素对抑制裸鼠宫颈癌Hela细胞移植瘤的生长，促进瘤体组织细胞的凋亡有明显效果，其机制可能与抑制PI3K/AKT 通路活化有关。