多穗柯MYB转录因子的鉴定及适应光因子调控黄酮类合成成员的筛选1)

张妍彤 张杰 赵红霞 李苹 宋鑫 龙月红

(菏泽医学专科学校,菏泽,274000) (华北理工大学) (菏泽医学专科学校) (华北理工大学)

多穗柯(LithocarpuspolystachyusRehd),民间称之为大叶椆子、甜茶,属于壳斗科(Fagaceae)石柯属(Lithocarpus)常绿乔木。广泛分布于中国南部、印度和泰国等地[1],在我国主要分布于长江以南各地海拔400 m以上的密林中[2]。多穗柯叶片中富含具有药理活性的黄酮类化合物,作为民族、民间药物被广泛应用[3]。本世纪以来,对多穗柯的研究逐渐增多,药理学研究表明,多穗柯黄酮类化合物在降血糖[4-5]、调血脂[6-7]、调节血压[8]等方面具有独特的疗效。

光照是植物光合作用主要的能量来源,在植物的生长发育、形态建成等方面具有重要的作用。同时,光因子也可影响植物的次生代谢过程,如光照对许多植物的黄酮、黄酮醇和花色素苷等黄酮类化合物的合成都具有显著的影响[9]。光因子主要包括光质、光强、光周期等。对多穗柯的研究表明,给予多穗柯绿光刺激,或适当的降低光照强度,亦或适当延长光照时间,可显著促进多穗柯中黄酮类化合物合成相关结构基因在转录水平的表达,进而提高黄酮类化合物的合成和积累[10],但其调控机制尚不清楚。

对多种植物的研究表明,包括MYB转录因子在内的多种转录因子参与黄酮类化合物生物合成过程的表达调控[11]。其中,MYB是一类在植物中成员数量最多、类型最为多样化的调节基因家族,其功能涉及植物发育和代谢的各个方面,尤其是在调控环境胁迫、调节次生代谢等方面发挥着不可或缺的作用[12]。在拟南芥(Arabidopsisthaliana)中,参与黄酮类化合物合成的查耳酮合酶、黄酮羟化酶和黄酮合酶等基因的表达,均受到各自启动子与MYB转录因子结合情况的调控[13]。在桃树(Prunuspersica)中,PpMYB10可以正向调节黄酮类生物合成途径中,结构基因类黄酮糖基转移酶(UFGT)和二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)的上游启动子[14]。苹果MdMYB10可以上调DFR基因的表达,从而改善苹果皮、果肉和叶片中花青素的合成[15]。对银杏(Ginkgobiloba)的研究进一步证实,蓝光照射导致编号为Gb_39081的MYB转录因子表达水平发生改变,使Gb_39081直接与参与银杏黄酮类化合物合成的结构基因CHS、F3H和FLS的启动子结合,调节其表达,最终影响银杏的黄酮类的生物合成[16]。这说明,MYB转录因子在参与调控植物黄酮类化合物的生物合成,尤其是光照影响黄酮类代谢的过程中,发挥着重要作用。然而,MYB转录因子家族在多穗柯中的成员构成、类型特点及哪些成员参与了光因子调节多穗柯黄酮类的合成过程尚未见报道。

本研究利用不同光处理条件的多穗柯转录组数据,筛选鉴定其MYB转录因子基因家族,明确不同光照条件差异表达的多穗柯MYB转录因子;进一步进行MYB转录因子保守基序和结构域的分析,了解MYB转录因子的类型;根据转录组测序数据,筛选适应光因子变化,进而调控多穗柯黄酮类化合物合成的MYB转录因子。以期为多穗柯中MYB转录因子的功能研究和选择、利用各种基因工程手段筛选适应光因子的多穗柯MYB候选基因提供参考。

1 材料和方法

多穗柯MYB转录因子的筛选鉴定。以先期获得的多穗柯的转录组测序数据[10]为基础。在Interpro数据库(http://pfam.xfam.org/)中下载MYB转录因子的隐马尔可夫(HMM,PF09316)模型。使用HMMER程序在多穗柯转录组测序数据的蛋白数据中搜索、筛选MYB转录因子结构域,设定E值为10-5进行结构域筛选。将筛选得到的序列再次进行生物大分子序列比对(BLAST),构建LpMYB转录因子特异性的结构域模型,设定E值为10-6再次筛选。将2次搜索得到的序列通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)的CD-Search功能和蛋白结构域数据库(SMART,http://smart.embl-heidelberg.de/smart/set_mode.cgi?NORMAL=1)等分析后,进一步确认筛选得到的基因。

多穗柯MYB转录因子理化性质分析方法。通过在线网站Prosite蛋白质功能位点数据库(http://www.expasy.org/prosite/)对筛选出的LpMYB转录因子的蛋白质理化性质进行预测。

多穗柯MYB转录因子的进化分析方法。使用多序列比对(ClustalW)软件对筛选得到的LpMYB转录因子蛋白质序列及拟南芥的8个MYB转录因子为外类群,进行多序列比对,使用分子进化遗传分析(MEGA Ⅹ)软件(http://www.megasoftware.net/),通过最大似然法构建LpMYB转录因子的系统发育进化树,设置自展值为1000,并根据结构域特征和系统发育关系对LpMYB转录因子进行分组。利用进化树在线编辑软件Evolview(https://www.evolgenius.info/evolview/)对构建的LpMYB转录因子系统发育进化树进行美化,明确多穗柯中LpMYB转录因子的分组。

多穗柯中MYB转录因子保守基序与结构域分析方法。使用在线网站MEME(http://meme-suite.org)分析LpMYB转录因子的基序,参数设定为:搜索基序总数为5,最短长度为6,最大长度为50。使用在线网站美国国家生物技术信息中心保守域数据库(NCBI CDD,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)分析LpMYB转录因子的保守结构域(使用默认参数)。使用生物学家工具盒(TBtools)[17]软件可视化LpMYB转录因子的保守基序与结构域。

多穗柯中MYB转录因子的表达分析方法。利用不同光照条件处理的多穗柯转录组测序数据[10],筛选差异表达的LpMYB转录因子和差异表达黄酮类物质合成相关结构基因,使用多穗柯不同光照条件的基因表达量信息,用TBtools软件绘制LpMYB转录因子的表达情况热图。

2 结果与分析

2.1 多穗柯MYB转录因子家族的鉴定和理化性质分析

在转录组测序数据中,共筛选、鉴定得到60个多穗柯LpMYB转录因子。LpMYB转录因子蛋白长度在114～816个氨基酸之间,TRINITY.DN129990.c0.g1蛋白的氨基酸数量最多(816个),TRINITY.DN144806.c0.g1蛋白的氨基酸数量最少(114个)。LpMYB转录因子蛋白的分子质量在13 228.20～89 696.81 u之间。60个LpMYB转录因子的理论等电点(pI)在4.87～10.21之间,其中38个LpMYB转录因子成员的理论pI>7,为碱性蛋白,22个LpMYB转录因子成员的理论pI<7,为酸性蛋白。LpMYB转录因子TRINITY.DN88128.c0.g1、TRINITY.DN62206.c0.g1、TRINITY.DN112113.c0.g2、TRINITY.DN113813.c0.g2和TRINITY.DN121643.c1.g1的不稳定系数小于40,其余LpMYB转录因子的不稳定系数均大于40。LpMYB转录因子的总平均亲水性均小于0,为亲水性蛋白。

表1 多穗柯MYB基因家族蛋白理化性质

2.2 多穗柯MYB转录因子的进化分析

使用最大似然法构建多穗柯和拟南芥MYB转录因子蛋白系统发育树(图1)。结果显示,60个LpMYB转录因子被划分为1R-MYB、R2R3-MYB、3R-MYB、4R-MYB,共4个亚组。其中R2R3-MYB亚组成员数量最多(26个),占总LpMYB转录因子的43.33%;3R-MYB和4R-MYB亚组的数量接近,分别有13、12个成员,占总LpMYB转录因子的21.67%、20%;1R-MYB亚组的成员数量较少,仅9个成员,占总LpMYB的15%。进化分析结果表明,多穗柯R2R3-MYB和3R-MYB的进化关系较近,1R-MYB和4R-MYB的进化关系较近。这种进化关系预示着R2R3-MYB和3R-MYB与1R-MYB和4R-MYB之间的功能存在较大差异。

图1 多穗柯和拟南芥MYB转录因子蛋白系统发育树

2.3 多穗柯MYB转录因子家族保守基序分析

为了进一步揭示LpMYB的多样化,使用MEME和NCBI CDD分析了该家族中的保守基序和结构域(图2)。从60个LpMYB中共筛选到5种保守结构域,分布命名为:motif 1、2、3、4、5(图2A-a)。LpMYB转录因子具有十分相似的motif结构;R2R3-MYB、3R-MYB亚组的保守基序为motif 1、2和3;1R-MYB和4R-MYB亚组的保守基序以motif 3和4为主,在4R-MYB亚组存在特异的motif 5。共筛选到11个长19～267个氨基酸的保守结构域。各个亚组都有较为独特的保守结构域分布特点,如R2R3-MYB和3R-MYB亚组的LpMYB绝大多数均具有PLN03091超家族结构域,而myb_SHAQKYF则是1R-MYB和4R-MYB亚组的标志性保守结构域(图2A-b)。总体来看,1R-MYB和4R-MYB亚组呈现出与R2R3-MYB和3R-MYB亚组完全不同的motif特征,说明他们具有完全不同的生物学功能。同时,多数保守结构域和基序主要存在于LpMYB的N端区域,说明这些区域是MYB转录因子参与蛋白质-蛋白质的互作和转录调控活动的主要功能结构域。

A表示MYB蛋白进化关系,motif结构和MYB蛋白结构域整合图;B表示MYB转录因子motif结构;a表示MYB转录因子motif结构,b表示MYB转录因子保守结构域。

2.4 多穗柯MYB转录因子的表达分析

多穗柯LpMYB转录因子在不同光照条件下的表达情况如图3所示。在不同光周期条件下,随着光照时长的延长,大部分的LpMYB转录因子表达上调;在1 000 lx光照度照射下,TRINITY_DN91650_c0_g2、TRINITY_DN108216_c1_g1、TRINITY_DN93318_c0_g1、TRINITY_DN105293_c0_g1、TRINITY_DN86589_c0_g1、TRINITY_DN106697_c0_g1表达显著上调;在2 000 lx光照度照射下,TRINITY_DN61983_c0_g1、TRINITY_DN61657_c0_g1、TRINITY_DN29014_c0_g2、TRINITY_DN121130_c1_g1、TRINITY_DN46695_c0_g1、TRINITY_DN85858_c1_g7、TRINITY_DN80404_c0_g1、TRINITY_DN106076_c0_g同样表达显著上调;在光照度达到3 000 lx时,LpMYB转录因子表达整体下降。在一定限度内,LpMYB转录因子表达随着光照度的增强而提高。表达水平随着光照度的增大到达最大值后,进一步增大光照度,LpMYB转录因子表达下调。红光胁迫时,LpMYB转录因子的表达呈现上调趋势;在蓝光和绿光条件时,多数LpMYB转录因子的表达出现下调的趋势。大部分LpMYB转录因子能够适应红光胁迫;长时间的光照、适当的光照度提高了LpMYB转录因子的表达。

CK为自然光条件的叶片样本;GC8h为8 h光照、16 h黑暗白光胁迫的表达情况,GC11h为11 h光照、13 h黑暗白光胁迫的表达情况,GC14h为14 h光照、10 h黑暗白光胁迫的表达情况;GQ2、GQ4、GQ6分别为1 000、2 000、3 000 lx光照度胁迫处理;HongG、LanG、LvG分别表示红光、蓝光、绿光胁迫处理。

2.5 多穗柯MYB转录因子和黄酮类物质合成基因的共表达分析

拟南芥中许多MYB转录因子的功能已被确定,Dubos et al.[18]按照不同的功能将MYB转录因子进行了分类,其中,调控黄酮类物质生物合成的MYB转录因子被划归为S4、S5、S6和S7亚族。S4亚族的AtMYB4能够以紫外线(UV)依赖的方式控制芥子酸酯生物合成[19];S6亚族的AtMYB75/PAP1、AtMYB90/PAP2、AtMYB113和AtMYB114控制营养组织中的花青素生物合成[20];S7亚族中的AtMYB11/PFG1、AtMYB12/PFG1和AtMYB111/PFG3控制所有组织中的黄酮醇生物合成[21]。调控黄酮类物质生物合成的S4、S5、S6和S7亚族在结构上属于R2R3-MYB亚族,R2R3-MYB基因主要作为转录激活剂,参与调节植物的特异性过程[22]。MYB转录因子的这些功能,在不同被子植物中对于同一亚群的MYB蛋白是广泛保守的。通过生物信息学分析,在多穗柯中,共鉴定得到10个参与黄酮类化合物生物合成的LpMYB转录因子,这些转录因子被划分入3个组(表2)。这10个LpMYB转录因子的表达水平随着光照时间的延长略有增加,但总体差异不大。在光照度达到3 000 lx时,这10个LpMYB转录因子出现不同程度的表达下调。在红光胁迫时,LpMYB转录因子的表达量最高。

表2 参与黄酮类化合物生物合成的LpMYB转录因子FPKM值

我们进一步筛选出差异表达的多穗柯黄酮类化合物合成相关结构基因PAL、C4H、4CL、CHS3、CHI和ANS等。PAL、C4H、CHS3、ANS基因在不同光照条件的表达情况如表3所示。在光照度2 000 lx处理(GQ4)时,多穗柯ANS和CHS3基因显著高表达,同时S6亚组TRINITY_DN80404_c0_g1基因在2 000 lx处理(GQ4)时高表达。因此推测,TRINITY_DN80404_c0_g1在光照度胁迫时参与调控多穗柯ANS和CHS3的表达,进而参与控制多穗柯黄酮类的生物合成。不同光照时间处理时,PAL基因在8 h光照、16 h黑暗(GC8h)和11 h光照、13 h黑暗(GC11h)的表达差异不显著,在14 h光照、10 h黑暗(GC14h)处理时,表达显著上调,S7亚组的TRINITY_DN120089_c0_g1基因也在14 h光照、10 h黑暗(GC14h)处理时高表达,表明多穗柯TRINITY_DN120089_c0_g1基因可能参与调控PAL基因的表达,进而影响黄酮醇生物合成。

表3 PAL、C4H、CHS3、ANS基因不同处理时的基因FPKM值

多穗柯黄酮类合成结构基因与S4、S6和S7亚组中10个LpMYB转录因子表达量的相关性分析结果显示,PAL、C4H、CHS3、ANS基因分别与一个或两个LpMYB转录因子之间存在正相关关系(表4)。其中,S7亚族的LpMYB转录因子TRINITY_DN120089_c0_g1与PAL基因存在正相关关系,拟南芥S7亚族可以调控黄酮醇的生物合成,因此推测LpMYB转录因子RINITY_DN120089_c0_g1在多穗柯黄酮类生成早期发挥重要作用,能够显著影响PAL基因的表达。S6亚族的LpMYB转录因子TRINITY_DN80404_c0_g1同时与CHS3和ANS基因存在较强的相关性,推测TRINITY_DN80404_c0_g1具有与拟南芥S6亚族MYB转录因子调节黄酮类化合物合成的类似作用。

表4 多穗柯MYB转录因子与黄酮类物质合成基因的皮尔逊相关系数

3 结论与讨论

MYB作为植物中最大的转录因子基因家族之一,在植物生长发育、细胞形态建成、初级和次级代谢反应以及对环境胁迫的适应等多种生物过程中,发挥着重要作用[12]。MYB在作物中的功能已被广泛研究,但在药用植物中的研究很少[23]。本研究首次对多穗柯中的MYB转录因子家族进行了鉴定,共筛选找到60个LpMYB,分别为R2R3-MYB亚组成员26个,3R-MYB亚组成员13个,4R-MYB亚组成员12个,1R-MYB亚组成员9个,其中,R2R3-MYB是数量最多的一类。R2R3-MYB可调控植物中黄酮类化合物的生物合成[24]。在滇牡丹[25](PaeoniasuffruticosaAndr.)、糙苏[26](PhlomisumbrosaTurcz.)、掌叶大黄[27](RheumpalmatumL.)和过路黄[28](LysimachiachristinaeHance)等物种的转录组数据中,分别鉴定得到64、61、49、51个MYB转录因子,多穗柯的60个LpMYB转录因子和这些物种转录组数据中鉴定得到的MYB转录因子数目相差不大,且亚组成员分布情况基本一致。表明通过转录组测序数据获得的LpMYB序列与基因信息,较为可靠,能够为研究多穗柯的MYB转录因子提供有效参考。将60个LpMYB与作为参考类群的拟南芥不同亚组的MYB进行系统发育分析,结果表明,来自拟南芥的MYB蛋白依次被分入对应的1R-MYB,R2R3-MYB,3R-MYB和4R-MYB亚组,其中R2R3-MYB和3R-MYB的进化关系较近。

已有的研究表明,不同植物中,MYB的理化性质非常相似[29]。本研究发现,LpMYB蛋白的分子质量范围为13 228.20～89 696.81 u,预测蛋白的pI为4.87～10.21。马铃薯MYB蛋白的分子质量范围为5 890～113 390 u,pI为4.59～10.26[30];水稻MYB蛋白的分子质量范围为7 610～109 410 u,pI为3.99～12.26[31];花椒MYB蛋白的分子质量范围为10 100～60 280 u,pI值为4.3～9.9[32]。这表明MYB转录因子基因家族在进化上相对保守。

不同物种间的直系同源基因,如多穗柯的MYB和拟南芥的MYB,通常可以在物种分化形成后,继续维持其原有的功能,因此,借助其他物种已知功能的MYB构建系统发育树,可用于推断MYB的基因功能[33]。作为模式植物,大多数拟南芥的MYB均具有详细的功能鉴定。R2R3-MYB在植物生长、发育、黄酮类代谢途径和胁迫调节中具有关键作用[34],3R-MYB在G2/M转变期间的细胞周期控制中发挥重要作用[35],但有关1R-MYB和4R-MYB亚组的作用尚未得到系统的验证。目前,在拟南芥中已经发现4个亚族(S4、S5、S6、S7)中的MYB是调节黄酮类化合物生物合成所必需的,因此多穗柯中相应的直系同源LpMYB也具有相同的功能。例如,S6亚族的拟南芥MYB参与调剂花青素等黄酮类的生物合成[20];S7亚族中的的MYB在拟南芥被发现,可控制所有组织中黄酮类的生物合成[21];而S4亚族的拟南芥MYB,主要是控制芥子酸酯生物合成[19]。因此可以推测,多穗柯中S6和S7亚族的LpMYB为调控其黄酮类合成的MYB。不同光照条件下,LpMYB的表达变化及其与多穗柯黄酮类合成结构基因共表达分析的结果表明,S6亚族的TRINITY_DN80404_c0_g1与多穗柯的ANS和CHS3基因的表达显著相关,S7亚族TRINITY_DN120089_c0_g1基因与多穗柯的PAL基因表达显著相关。因此可以推测,TRINITY_DN80404_c0_g1和TRINITY_DN120089_c0_g1可分别适应光因子的变化后,作用于多穗柯的ANS、CHS3基因和PAL等基因,改变这些结构基因的表达水平,进而调控多穗柯的黄酮类化合物的合成。这一推测也得到了银杏中编号为Gb_12012的MYB[16]和短莛飞蓬(Erigeronbreviscapus)[36]中的EbMYBP1,作为细胞核定位的转录激活剂,适应外界光因子的变化或其他刺激后,通过直接结合结构基因的启动子来激活黄酮类合成结构基因的转录,进而促进黄酮类积累的佐证。

综上所述,在多穗柯全基因组测序尚未完成的条件下,本研究在转录组学水平上,对LpMYB转录因子进行了鉴定,并对其进行了与黄酮类合成结构基因的共表达的联合分析,找到了适应光因子变化,并调控多穗柯黄酮类合成的LpMYB,研究结果为后续进一步证实LpMYB的各种生物学功能,揭示LpMYB调控多穗柯黄酮类化合物生物合成的分子机制,丰富多穗柯次生代谢的调控理论提供参考。