健脾化瘀方治疗结直肠癌脾虚瘀毒型的疗效及对肠道菌群和免疫功能的影响※

孟春芹 刘先勇 吴 皞 马 玲△

(1.南京医科大学附属江宁医院中西医结合科,江苏 南京 211100;2.南京医科大学附属江宁医院肿瘤科,江苏 南京 211100)

结直肠癌(colorectal cancer,CRC)全球发病率位居第3,严重威胁着人类的健康[1]。多项研究表明大肠癌患者肠道微生态出现严重失调[2],肠道菌群可通过影响某些毒性物质的代谢、诱发肠道炎性反应、破坏肠屏障功能、抑制机体免疫功能等多种途径促进肠癌的发生[3-7]。前期我们发现肠癌患者的肠道细菌不管是在门(phylum)、科(Family)、属(Genus)、种(Species)还是纲(class)上确实与健康人都存在一定差别。研究显示,中医中药不仅能改变肠道菌群的结构并影响肠道菌代谢,还可直接作用于肠道细胞,影响肠道细胞的数量和功能,从而发挥抗肿瘤作用[8-11]。2020年10月至2021年9月,我们在常规抗肿瘤及对症治疗基础上予健脾化瘀方治疗CRC脾虚瘀毒型23例,并与常规抗肿瘤及对症治疗23例对照,观察对患者肠道菌群及临床疗效的影响,结果如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取南京医科大学附属江宁医院中西医结合科晚期CRC患者46例,按照随机数字表法分为2组。治疗组23例,男13例,女10例;原发结肠癌15例,直肠癌8例;低分化8例,高、中分化14例。对照组23例,男14例,女9例;原发结肠癌13例,直肠癌12例;低分化12例,高、中分化11例。2组一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。

1.2 病例选择

1.2.1 诊断标准 参照《国家卫健委中国结直肠癌诊疗规范解读(2020版)—外科部分》[12]中CRC的诊断标准,原发灶为结肠、直肠;TNM分期为Ⅳ期。参照《中华人民共和国国家标准:中医临床诊疗术语证候部分》[13]及《中药新药临床研究指导原则(试行)》[14]中相关内容,辨证为脾虚瘀毒型。主症:腹部隐痛,或胀痛,纳呆,大便稀溏,或有黏液血便;兼症:面色少华,体倦乏力,口淡不渴,食后腹胀,恶心欲吐;舌苔:舌质淡紫或有瘀点、瘀斑;脉象:脉沉细或细弦或涩。含上述任2项主症、1项及以上兼症,参照舌苔、脉象可辨证为脾虚瘀毒型。

1.2.2 纳入标准 年龄≥18周岁;预计生存期≥3个月;卡氏功能状态评分(KPS)[12]≥80分;本研究经南京医科大学附属江宁医院医学伦理委员会批准,患者自愿签署知情同意书。

1.2.3 排除标准 二重癌或多重癌;合并有严重的可能明显影响治疗和预后的脏器疾病,如心、脑、肺、肝脏、肾脏、神经系统疾病者;妊娠、哺乳期妇女;正在参加其他临床试验者。

1.3 治疗方法

1.3.1 对照组 予常规抗肿瘤治疗(化疗、靶向治疗等)及对症治疗(止泻、消炎等)。

1.3.2 治疗组 在对照组治疗基础上予健脾化瘀方。药物组成:太子参15 g,黄芪15 g,炒白术10 g,茯苓10 g,薏苡仁20 g,白花蛇舌草10 g,重楼10 g,莪术10 g,丹参10 g。日1剂,水煎2次取汁300 mL,分早、晚2次饭后1～2 h服,每4周根据临床症状调整用药。

1.3.3 疗程 2组均治疗12周。

1.4 观察指标及方法 ①比较2组疗效。②肠道菌群检测:收集患者新鲜粪便,取0.5 g加入0.9%氯化钠注射液中,分别按双歧杆菌、乳酸杆菌、肠杆菌、粪肠球菌的菌种稀释相应倍数,取稀释液10 μL分别接种至37 ℃需氧培养箱和厌氧菌培养箱中培养48 h,最后计算每克粪便湿重中菌落形成单位(CFU),并以对数值表示(logCUF/g)。③收集患者血清,根据酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒说明书按步骤检测患者治疗前后炎症因子白细胞介素(IL)1β、IL-6、肿瘤坏死因子α(TNF-α)及免疫细胞CD3+、CD3+CD4+、CD19+变化。④收集患者治疗前后血标本,实时荧光定量多聚核苷酸链式反应实验(RT-PCR)检测外周血血清中Toll样受体4(Toll-like receptors 4,TLR4)、核因子κBp65(nuclearFactor κB,NF-κBp65)水平。⑤记录患者治疗期间不良反应发生情况。

1.5 疗效标准 显效:腹痛、腹胀、大便性状等有所减轻、改善,症状积分减少>70%;有效:腹痛、腹胀等症状有所缓解,症状积分减少 30%～70%;无效:上述症状未见任何改善,甚至加剧,症状积分减少<30%[14]。总有效率=(显效例数+有效例数)/总例数×100%。

2 结果

2.1 2组疗效比较 治疗组总有效率为86.96%(20/23),对照组总有效率为56.52%(13/23),2组总有效率比较差异有统计学意义,治疗组疗效优于对照组(P<0.05)。见表1。

表1 2组疗效比较 例

2.2 2组治疗前后肠道菌群比较 治疗组治疗后双歧杆菌、乳酸杆菌均较本组治疗前升高(P<0.05),肠杆菌、粪肠球菌均较本组治疗前降低(P<0.05);治疗后治疗组双歧杆菌、乳酸杆菌均高于对照组(P<0.05),肠杆菌、粪肠球菌均低于对照组(P<0.05),2组治疗后双歧杆菌、乳酸杆菌、肠杆菌、粪肠球菌比较差异有统计学意义。对照组治疗前后肠道菌群比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 2组治疗前后肠道菌群比较

2.3 2组治疗前后血清炎症因子比较 治疗组治疗后IL-1β、IL-6、TNF-α水平均较本组治疗前降低(P<0.05),治疗后治疗组IL-1β、IL-6、TNF-α水平均低于对照组(P<0.05);对照组治疗前后IL-1β、IL-6、TNF-α水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 2组治疗前后血清炎症因子比较

2.4 2组治疗前后免疫功能指标比较 治疗组治疗后CD3+、CD3+CD4+、CD19+水平均较本组治疗前升高(P<0.05),治疗后治疗组CD3+、CD3+CD4+、CD19+水平均高于对照组(P<0.05)。对照组治疗前后CD3+、CD3+CD4+、CD19+水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 2组治疗前后免疫功能指标比较

2.5 2组治疗前后TLR4、NF-κBp65 mRNA水平比较 治疗组治疗后TLR4、NF-κBp65 mRNA水平均较本组治疗前降低(P<0.05),治疗后治疗组TLR4、NF-κBp65 mRNA水平均低于对照组(P<0.05)。对照组治疗前后TLR4、NF-κBp65 mRNA水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表5。

表5 2组治疗前后TLR4、p65 mRNA水平比较

2.6 2组不良反应发生情况比较 2组治疗期间均未发生不良反应情况。

3 讨论

肠道菌群是人体肠道内的正常微生物,人体内含有约100万亿个肠道菌,它所编码的基因是人类基因组的100倍,被称为宏基因组或“人体第二基因组”[15]。其按功能主要被分为3大类:益生菌、条件致病菌和致病菌。正常情况下,肠道可保持其免疫平衡状态,但是当肠道菌群的稳定状态被打破后,微生物就会在肠道引发长期慢性的炎症反应,形成“损伤-修复-损伤”的恶性循环,使肠道组织细胞出现病理损伤或癌变[16]。前期我们通过16S rRNA测序技术分析健康人与CRC患者的肠道菌群情况,结果发现,大肠癌患者肠道菌群门、纲、属等的前20种与健康人在比例上确实存在很大的差别。

因CRC患者肠道菌群稳态遭到破坏,致病菌丰度明显升高,益生菌丰度降低,从而影响机体对营养物质的消化吸收,出现腹胀、腹泻、食欲减退等症状[17]。而这一系列症状则是中医学“脾虚”的主要症候。王瑞平教授认为,CRC多是由于长期饮食不节、或劳倦过度、或忧思抑郁、或久病失养,最终损伤脾胃,导致气血生化乏源,正气虚损,邪气乘袭,蕴结于肠腑,气机受阻,血行不畅,痰瘀毒结,形成肠癌。CRC基本病机为脾气虚弱,瘀毒内结,因此提出健脾化瘀法。健脾化瘀方中大量运用补气健脾药如太子参、黄芪、炒白术、茯苓、薏苡仁改善脾虚以治本;白花蛇舌草、重楼、莪术、丹参解毒活血消癥以治标。本研究结果显示,治疗组患者通过口服健脾化瘀方汤剂,腹痛、腹胀、纳差、腹泻、乏力等症状明显改善,有效率高达86.96%。对照组患者通过止泻、消炎等对症处理后临床有效率为56.52%,组间比较差异有统计学意义(P<0.05),表明健脾化瘀方可显著改善患者的临床症状,提高患者生活质量。

多项研究证实机体免疫、肠道菌群与CRC之间存在着密切的相关性。肠道菌群是机体肠道屏障的重要组成部分,可通过促进黏膜免疫系统发育、诱导免疫应答反应等影响肠道内免疫细胞的数量,在黏膜免疫系统中发挥重要作用。同时,肠道菌群可刺激机体肠道形成更多的淋巴组织,并增加免疫球蛋白在血浆和肠黏膜中的水平,调节免疫系统的活跃性[18]。本研究结果显示,治疗后治疗组双歧杆菌、乳酸杆菌均较本组治疗前升高(P<0.05),肠杆菌、粪肠球菌均较本组治疗前降低(P<0.05),且与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。说明通过口服健脾化瘀方汤剂,可有效提高CRC患者粪便中的益生菌如双歧杆菌、乳酸杆菌数量,而减少致病菌肠杆菌、粪肠球菌数量。说明健脾化瘀方能有效调节CRC患者肠道菌群,增加有益菌,减少致病菌。治疗组治疗后CD3+、CD3+CD4+、CD19+水平均较本组治疗前升高(P<0.05),治疗后治疗组CD3+、CD3+CD4+、CD19+水平均高于对照组(P<0.05)。说明健脾化瘀方在调节患者的肠道菌群同时,也增强了机体的免疫功能。

CRC的发生与肠道的慢性炎症密切相关。肠道炎症可刺激炎症细胞及IL-6、IL-8、TNF-α等炎症介质释放,制造了一个免疫抑制、炎症持续激活的微环境,通过其介导的细胞通路让肿瘤免疫失调;促炎性反应信号通路的异常激活,加剧肠道黏膜上皮细胞的损伤,进一步使肠道菌群微环境破坏,使肠道处于长期慢性炎症状态,继而增加CRC的发生率。本研究结果发现,治疗组患者治疗后血清炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平下降(P<0.05),且低于对照组(P<0.05),而对照组变化不明显,表明健脾化瘀方可降低CRC患者血清中炎症因子水平,降低炎性反应。

多项研究显示,Toll样受体作为机体炎症反应链的启动蛋白,从源头为炎症性肠病、乃至炎症相关性肠癌的发病机制的研究提供了新的方向。其中,TLR4是肠道免疫屏障的重要组成部分之一,当各种因素导致肠黏膜屏障破坏时,细菌产物接触到树突状细胞和巨噬细胞,通过TLR4介导的信号通路最终触发NF-κB的激活,产生持续扩大的炎症反应,刺激肿瘤细胞的增生。同时,在结直肠组织中高表达及NF-κB的激活是TLR4/NF-κB通路在发病作用中的关键环节,也是炎症性肠病治疗研究中极受重视的靶位。本研究结果显示,2组治疗后TLR4、NF-κBp65 mRNA水平均较本组治疗前降低(P<0.05),治疗后治疗组TLR4、NF-κBp65 mRNA水平均低于对照组(P<0.05)。说明健脾化瘀方在改善CRC患者临床症状及调节肠道菌群、免疫功能的作用可能是通过下调TLR4/NF-κB而发挥作用的。但本研究未进一步进行验证,将在后续研究中进一步探讨两者之间的关系。

综上所述,健脾化瘀方治疗CRC脾虚瘀毒型,可有效改善患者临床症状,调节患者肠道菌群,提高机体免疫功能,降低血清炎症因子水平,可能与调节TLR4/NF-κB有关。