1株黄牛源多源曼氏杆菌的分离鉴定与转铁结合蛋白B结构预测

朱玉红,张疏桐,李志玲,徐雨蓓,杨雪赢,张贵东,韦国山,甘 玲,2*,郭建华,2*

(1.西南大学 动物医学学院,重庆402460;2.西南大学 医学研究院免疫学研究中心,重庆 402460)

牛呼吸道疾病综合征(bovine respiratory disease complex,BRDC)是一类多种病原、多种诱因导致的传染性疾病,可引起牛肺炎、运输热、支气管炎等病症[1],严重危害肉牛养殖业[2]。导致牛呼吸道疾病综合征的细菌性病原主要是多杀性巴氏杆菌、溶血曼氏杆菌、睡眠嗜血杆菌等巴氏杆菌科革兰阴性菌[2]。其中,曼氏杆菌属细菌是巴氏杆菌科中引起BRDC最重要的一个属[3]。

曼氏杆菌属(Mannheimia),原归属于溶血巴氏杆菌A型[4-5],ANGEN等[6]根据Southern杂交及16S rRNA序列分析的结果,建议建立这一新属,至少包含5个种,分别为:溶血性曼氏杆菌(Mannheimiaheamolytica)、肉芽肿曼氏杆菌(Mannheimiagranulomatis)、葡萄糖苷曼氏杆菌(Mannheimiaglucosida)、反刍动物曼氏杆菌(Mannheimiaruminalis)、多源曼氏杆菌(Mannheimiavarigena)。其中,多源曼氏杆菌为多种反刍动物的上呼吸道及肠道的正常菌群,但当动物机体免疫力下降时,可引起牛的肺炎及乳腺炎,对养牛业造成严重的经济损失[7]。

转铁结合蛋白B(transferrin binding protein B,TbpB)是一些革兰阴性菌中暴露于外膜的脂蛋白,是巴氏杆菌科一些细菌重要的毒力因子,相对分子质量通常在60～100 kDa之间,TbpB作为外周蛋白, 具有一定的抗原性,易表达纯化而成为一个良好的疫苗设计的靶点,引起广泛的研究兴趣[8-10]。

本研究通过对某养殖场黄牛进行鼻拭子采集,从黄牛的鼻拭子中分离得到1株曼氏杆菌,并对该菌进行培养特性观察、生化试验、药敏试验、动物致病性试验、16S rDNA PCR扩增及测序,并对其TbpB基因进行了扩增、测序和结构预测分析,旨在鉴定该病原菌的药物敏感性和致病性,为疫病防制和疫苗研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 病料采集及病原分离某肉牛养殖场老龄牛,呼吸困难、喘粗气、流脓样鼻涕、咳嗽剧烈、被毛粗乱、四肢乏力、便血、站立不稳(图1),剖检发现肺纤维化严重,表面有白色渗出物,取剖检后鼻咽拭子、肺内容物等材料进行细菌细菌分离。将病料用无菌棉签划线接种于10%兔血巧克力琼脂培养基,置于恒温培养箱中,37℃烛缸培养24 h。经分离纯化后,得到1株细菌,命名为RC2110。

A.病牛临床表现;B.肺脏剖检病变

1.2 形态及培养特性观察挑取培养物中灰白色针尖大小可疑菌落,挑取该菌落,于5 mL BHI(脑心浸出液肉汤)培养基中37℃,220 r/min恒温振荡培养12 h,取37℃振荡培养12 h的菌液2.5 μL进行涂片,分别进行革兰染色、瑞氏-姬姆萨染色、孔雀石绿-番红染色,镜检。取BHI培养基中菌种,稀释至约109CFU/mL(D600=1.200),吸取菌液500 μL,加入500 μL 60%无菌甘油,置于-80℃保存。溶血性试验,取5 μL菌液,划线接种于10%绵羊血鲜血琼脂培养基,37℃恒温培养24 h,观察其是否出现溶血。

1.3 生化特性鉴定分离菌RC2110分别接种于葡萄糖、山梨醇、半乳糖、七叶苷、枸橼酸盐等生化反应管,37℃恒温培养24 h,进行生化鉴定。

1.4 药敏试验吸取0.5麦氏浓度菌液200 μL,均匀涂布于BHI琼脂平板,待菌液吸收后,37℃烛缸培养24 h后测量各药物抑菌圈的大小(mm),根据药敏纸片说明书及抑菌圈直径大小判断分离菌株对各种药物的敏感程度。

1.5 动物致病性试验吸取1×109CFU/mL 分离株RC2110菌液0.2 mL,腹腔注射3周龄C57小鼠(体质量约20 g),每只注射0.2 mL,对照组小鼠注射0.2 mL生理盐水,每隔2 h观察小鼠行为;若小鼠死亡,立即剖检观察并取病变器官进行涂片、瑞氏染色、镜检。

1.6 16S rDNA PCR与转铁结合蛋白B(tbpB)基因的扩增用TaKaRa MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0试剂盒提取细菌基因组根据文献报道的16S rDNA通用引物及 GenBank中多源曼氏杆菌基因组,进行16S rDNA和tbpB基因PCR扩增,引物见表1,反应体系均为25 μL:Premix TaqTM(TaKaRa TaqTMVersion 2.0 plus dye) 12.5 μL,上、下游引物(10 mmol/L,由重庆擎科兴业生物技术有限公司合成)各1.0 μL,菌液(108CFU/mL)0.5 μL,以及将ddH2O补至25.0 μL。反应条件:95℃预变性5 min,95℃变性30 s,53℃退火30 s,72℃延伸90 s,共35个循环;72℃10 min,4℃保温。将PCR产物用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0胶回收试剂盒进行切胶回收后,送至重庆市擎科兴业生物技术有限公司进行16S-27F单向测序和tbpB序列测通。

表1 试验相关引物序列及扩增片段长度

1.7 16S rDNA基因序列及TbpB氨基酸序列进化分析根据GenBank中检索巴氏杆菌科各种菌的代表菌株16S rDNA序列,与分离株RC2110进行序列比对分析,并构建N-J系统发育树。同时,将测通后的tbpB基因序列转换为氨基酸序列后,找到分离株RC2110 TbpB开放阅读框,在NCBI上检索流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)、副猪嗜血杆菌(Haephilusparasuis)、溶血性曼氏杆菌(Mannheimiahaemolytica)、海藻糖比伯斯坦菌(Bibersteiniatrehalosi)、淋病奈瑟菌(Neisseriagonorrhoeae) 等的tbpB,通过生物信息学软件MEGA 7.0进行N-J系统发育树的构建。

1.8 TbpB的结构预测分析通过I-tasser在线预测,以已经发表的猪胸膜肺炎放线杆菌TbpB晶体结构为模板,对分离株RC2110 TbpB三维结构进行预测,保存为pdb格式。

2 结果

2.1 分离株RC2110生长状况及形态

2.1.1分离株RC2110生长状况 病牛鼻拭子培养物在巧克力琼脂平板上可见生长良好,光滑、灰白色、透明、微凸起菌落,直径2～3 mm,在10%绵羊血鲜血琼脂上生长良好,有较明显的溶血现象,在BHI液体培养基中生长良好,可在麦康凯琼脂上贫瘠生长,48 h后可产生针尖大小红色菌落,LB琼脂不生长(图2)。

A.10%兔血巧克力琼脂培养基;B.10%绵羊血鲜血培养基;C.麦康凯琼脂培养基;D.LB琼脂培养基

2.1.2分离株RC2110镜检形态 如图3所示,革兰染色可见革兰阴性、短棒状杆菌,可聚集成细长杆状;瑞氏-姬姆萨染色可见明显两极着染杆菌,孔雀石绿-番红染色未见芽孢。

A.革兰染色 B.瑞氏-姬姆萨染色 C.孔雀石绿-番红染色

2.2 细菌生化试验由分离株RC2110生化试验结果,可知分离株RC2110甲基红、二乙酰、靛基质等试验为阴性,触酶试验、β-半乳糖苷试验、硝酸盐还原试验为阳性,不发酵阿拉伯糖、半乳糖、海藻糖、麦芽糖等(表2),结合细菌生长状况可鉴定为多源曼氏杆菌,与文献[10]报道的生化结果一致。

表2 分离株RC2110生化鉴定结果

2.3 药敏试验如表3所示,该分离菌株对氨基糖苷类、β-内酰胺类抗生素有较强的耐药性,对头孢哌酮和氟喹诺酮类药物敏感。

2.4 分离株动物致病性试验结果注射菌液2 h后,小鼠精神沉郁、被毛粗乱、行动迟缓、呼吸急促,呈现腹式呼吸;4 h后,小鼠死亡1/2;6 h后小鼠全部死亡。将死亡小鼠剖检,结果如图4所示,与对照组(图4A)相比,注射菌液死亡小鼠肺部肿胀,出血严重(图4B),取肺脏组织进行触片,瑞氏染色,油镜下可见两极着染杆菌(图4C,红圈处),与预期结果相符。

表3 药敏试验结果

2.5 16S rDNA与tbpB基因PCR结果如图5所示,分离株RC2110 16S rDNA 和tbpBPCR扩增片段大小均与预期相符。

2.6 16S rDNA与TbpB系统发育树构建结果采用Neighbor-Joining(NJ)法,利用生物信息学软件MEGA7.0 对已完成测序分离株RC2110 16S rDNA和TbpB进行系统发育树的构建,结果分别见图6,7,结果显示分离株16S rDNA基因序列与牛曼氏杆菌ZY190616株、肉芽肿曼氏杆菌ATCC49244株、多源曼氏杆菌10299株相似性最高,位于同一簇内,相似性超过97%,与腔隙莫拉菌相似性最低。分离株TbpB序列与溶血曼氏杆菌、多源曼氏杆菌相似性较高,位于同一簇内,但与其他菌的TbpB序列相似性较低。

A.对照组小鼠;B.注射菌液死亡小鼠;C.死亡小鼠肺脏触片瑞氏染色结果

图6 基于16S rDNA序列构建的系统发育树

2.7 TbpB结构预测分析结果分离株RC2110 TbpB是由586个氨基酸残基构成的双叶蛋白,由羧基端小叶(C-lobe)和氨基端小叶(N-lobe)组成,其中C-lobe有243个氨基酸残基(绿色),N-lobe有278个氨基酸(洋红色),红色线状结构为N末端,约66个氨基酸残基,被称为“锚定”结构,插入细菌外膜(图8A)。每个小叶均由1个β-筒结构域(青色)和1个手柄结构(黄色)构成(图8B)。

A.表面结构图;B.卡通结构图

3 讨论

巴氏杆菌科细菌主要寄生于哺乳动物和鸟类上呼吸道和消化道黏膜上,产生致病作用,多为需氧及兼性厌氧菌[11]。曼氏杆菌属作为巴氏杆菌科的一个属,最初被认定为溶血巴氏杆菌,1999年,ANGEN等[6]通过Southern杂交和16S rRNA序列分析,确立了新的曼氏杆菌属并将Mannheimiavarigena等6个种归为新的曼氏杆菌属[12]。

多源曼氏杆菌为革兰阴性短杆菌,不发酵大多数糖、醇类物质[4,7,13]。随着贸易的发展,多源曼氏杆菌引起的疾病在国内外时有发生,在我国吉林省[7]、爱尔兰[14]、印度[6]和日本[15]均有该菌的分离报告。通过相关文献可知,该菌可引起牛肺脏、肾脏、脑膜炎、乳房炎[16-17]等病变,并导致牛的死亡[14],可在牛乳中分离到该菌[13]。该菌对养牛业危害极大,但目前在我国报道较少。目前,细菌对抗生素的耐药问题相当突出,细菌可通过减少抗生素流入量或增加抗生素外排、改变抗生素的分子性状、修饰抗生素的靶标位点等方式使其产生抗生素耐药性[17]。针对抗生素耐药性,可通过使用抗菌肽、增强细菌代谢、选择抗生素佐剂、选择合适的细菌抗生素酶抑制剂、联合用药等[18-19]。结合本菌的药敏试验结果,可选择喹诺酮类药物和头孢哌酮钠舒巴坦钠进行联合用药抗菌治疗。

TbpB是一种存在于细菌外膜表面的可溶性脂蛋白,2009年,有研究猪胸膜肺炎放线杆菌TbpB结构发现,猪胸膜肺炎放线杆菌TbpB为双亚基蛋白,有N-lobe(橙色)和C-lobe(黄色)2个亚基,每个亚基都含有1个8条肽链构成的β筒和1个富含β折叠结构的手柄结构域[20]。N-lobe位于细菌膜外,能与来自宿主的转铁蛋白直接进行结合[21]。TbpB包含1个N-末端延伸(蓝色),称为“锚定结构”,TbpB通过该结构插入细菌外膜[8,22]。此外,LEE等[23]发现,TbpB作为外膜蛋白有较好的免疫原性,且在细菌铁获取中发挥重要作用,是细菌亚单位疫苗开发的理想蛋白。随着结构生物学研究的不断深入,越来越容易通过改变核酸碱基来改变蛋白结构,特别是在特定的位点改变重要氨基酸,来赋予新的蛋白新的功能。目前基于转铁蛋白受体为靶点的疫苗开发设计主要围绕着TbpB进行,因为TbpB外在蛋白,直接暴露在细菌外膜外面,很容易在大肠杆菌表达与纯化,被认为理想的疫苗设计靶点。一系列的TbpB结构被解析,各种来源的TbpB在结构上有保守性,通过在线预测与评价,本研究显示曼氏杆菌TbpB结构与转铁蛋白一样,也具有2个小叶组成:氨基端小叶(N-lobe)和羧基端小叶(C-lobe),且2个小叶各拥有1个β筒结构域和手柄结构域。

本研究对牛源多源曼氏杆菌进行了分离鉴定,并对其TbpB结构进行了模拟,为后续疫苗研发提供了理论基础。