猪流行性腹泻病毒纤突蛋白受体结合区(PEDV-RBD)重组蛋白的免疫原性

伊立超,郝嘉翼,邹万成,李乐天,姜宇航,张 爽,娄安钢,李 昌*,金宁一*

(1.延边大学 农学院,吉林 延吉 133000;2.中国农业科学院 长春兽医研究所,吉林 长春 130122;3.吉林农业大学 动物科技学院/动物医学院,吉林 长春 130118)

猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是尼多病毒目(Nidoviridae)、冠状病毒科(Coronaviridae)的α冠状病毒属成员,能够引起新生仔猪急性腹泻、呕吐、脱水甚至死亡。PEDV表面具有1个18～23 nm纤突的囊膜结构,纤突呈花瓣状,由核心向四周呈放射状分布,纤突末端呈球状;病毒直径为95～190 nm,是一种单股正链、不分节段RNA病毒。PEDV基因组大小约为28 kb,含有7个开放阅读框,分别编码大小为150 ～ 220 kDa的病毒纤突糖蛋白(S)、20～30 kDa的基质蛋白(M)、7 kDa的主要嵌膜蛋白(E)、58 kDa的核衣壳蛋白(N)与其他蛋白。病毒表面的纤突蛋白(spike,S)具有介导细胞附着和膜融合的作用[1]。某些哺乳动物冠状病毒的S蛋白能被相关的蛋白酶切割成S1和S2;S1具有受体结合位点,S2具有融合活性。S1区内318～510氨基酸残基可与ACE2[2-4]的肽酶域紧密结合。该片段为受体结合区(receptor-binding domain,RBD),是决定病毒-受体相互作用的关键序列,也决定着病毒的宿主范围和嗜性[5]。目前预防猪流行性腹泻(PED)的疫苗常用甲醛氢氧化铝灭活苗,但疫苗株与近期流行株同源性较低,能保护仔猪免受PEDV流行株感染的高效廉价的疫苗需求更加迫切[6]。为此,本课题组前期针对高发的GⅡ-a型流行株猪PEDV的纤突蛋白中的受体结合区(receptor-binding domain,RBD),应用杆状病毒表达系统构建并表达了PEDV-RBD基因[7],研究拟通过仔猪试验,分析其免疫原性,为PED亚单位疫苗研制提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 细胞、病毒与主要试剂SF9悬浮细胞系与PEDV(GenBank:OM814174.1)由本实验室保存;P3代重组杆状病毒(PEDV-RBD和pFastBacTMDual空载体)、PEDV-RBD蛋白(哺乳动物表达系统制备,质量浓度为0.75 g/L)、PEDV-RBD多克隆抗体由本实验室制备并保存[7];ImjectTMAlum佐剂购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司;双倍分子佐剂由南通海泰生物科技有限公司林旭埜博士惠赠;CpG序列由本实验室设计,南京金斯瑞生物科技有限公司合成;HRP标记的山羊抗猪IgG购自碧云天生物技术有限公司;SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5×)、猪外周血淋巴细胞分离液试剂盒购自天津灏洋生物科技有限公司;APC-CD3+、FITC-CD4+、PE-CD8+抗体购自美国BD公司。

1.2 动物3周龄断乳仔猪购自吉林省金泰美迪生物技术有限公司。

1.3 重组亚单位疫苗大量制备将P3代重组杆状病毒按照10 MOI接种到细胞密度为2×106个/mL的SF9悬浮细胞中,48 h收获细胞培养物,680 ×g离心10 min,收取上清。将1.2 L上清用超速离心机50 000 ×g离心2 h,弃上清,用6 mL PBS重悬沉淀。取20 μL用于鉴定和定量,其余分装冻存于-80℃冰箱。

1.4 目的蛋白的定量将重悬的沉淀按照体积比4∶1于SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5×)充分混合后煮沸10 min与哺乳动物表达的已知浓度PEDV-RBD蛋白作为标准蛋白同时进行SDS-PAGE电泳之后,将蛋白转印至NC膜上,以1∶1 000 稀释的PEDV-RBD多克隆抗体为一抗,1∶5 000 稀释的山羊抗鼠IgG为二抗,进行Western blot鉴定,重复3次。将Western blot结果进行灰度值分析,根据上样体积,按照公式:(标准蛋白浓度×上样体积)/标准蛋白灰度值=(目的蛋白浓度×上样体积)/目的蛋白灰度值,计算目的蛋白浓度[8]。

1.5 仔猪免疫试验设置3组,每组5只3周龄仔猪。RT-PCR方法(引物序列F:5′-ACTCTTCT-AGCTGGTACTGTGGC-3′;R:5′-ATCCTGCAA-AGCTGGAATGGC-3′,目的条带大约300 bp)筛选PEDV核酸阴性,间接ELISA方法筛选PEDV血清抗体阴性的仔猪。候选疫苗组仔猪颈部三角肌注射免疫原含量为500 μg,佐剂为ImjectTMAlum+双倍分子佐剂+500 μg CpG,与免疫原1∶1体积比混合振荡乳化10 min;pFastBacTMDual空载体上清和佐剂对照组为免疫对照组。首免后3周加强免疫,每周采血,分离血清保存待检。

1.5.1仔猪体温与体质量监测 每2 d测量仔猪体温和体质量,通过统计仔猪体温和体质量变化,分析亚单位疫苗及佐剂的安全性。

1.5.2特异性抗体检测 利用间接ELISA方法检测特异性抗体水平。根据本实验室建立的间接ELISA方法(数据待发表),血清稀释度为1∶400,二抗稀释度为1∶5 000,按照基本步骤检测仔猪血清特异性抗体[9]。

1.5.3中和抗体检测 参照文献[10]检测中和抗体水平。将灭活的血清从1∶2稀释至1∶1 024,每孔加200 TCID50PEDV,于37℃、5%CO2培养箱反应1 h,每孔加入约1×104个Vero细胞,置于培养箱2～3 d,观察细胞病变情况。

1.5.4流式细胞术分析 免疫后32 d,采集仔猪血液,利用猪外周血淋巴细胞分离液试剂盒分离仔猪淋巴细胞,用RPMI-1640培养基调整淋巴细胞数量为1×106个/mL,用抗猪APC-CD3+、FITC-CD4+、PE-CD8+染色孵育后利用流式细胞术分析CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞水平。

1.6 数据统计分析仔猪血清中特异性IgG水平、中和抗体水平,仔猪体温和体质量及CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞水平检测所得数据均采用GraphPad Prism 9.3.0数据统计软件进行分析,样本间显著性检验采用t检验。

2 结果

2.1 免疫原的定量将标准蛋白与制备的目的蛋白同时进行Western blot鉴定(图1),将显影的条带进行灰度值分析,重复3次,按照公式计算目的蛋白的质量浓度,经计算目的蛋白的质量浓度为1.02 g/L。

M.蛋白Marker;1.目的蛋白;2.空载体对照;3.标准蛋白

2.2 仔猪免疫试验

2.2.1阴性仔猪的筛选 选取15头仔猪,按照顺序进行编号,根据实验室建立的方法进行RT-PCR和间接ELISA检测,选取的仔猪核酸与抗体均为阴性的仔猪进行免疫试验。

2.2.2仔猪体温与体质量变化 仔猪每2 d测1次体温和体质量(图2):图2A可见仔猪体温维持在38.5～39.5℃之间,没有因为免疫而导致体温的大幅度波动;图2B可见各组仔猪体质量均保持稳定增长,首次免疫后体质量增长缓慢,可能与仔猪进食及生长环境有关,之后体质量逐渐上升。以上结果表明,免疫的目的蛋白及添加的佐剂并不影响仔猪的正常生长,安全性较高。

A.仔猪体温监测;B.仔猪体质量监测

2.2.3特异性抗体检测结果 仔猪每周采血,分离血清后利用建立的间接ELISA方法进行特异性抗体检测(图3)。疫苗组首免后抗体水平只有缓慢上升并很快降低,首免后21 d加强免疫后抗体水平迅速上升至较高水平,28和32 d的免疫组特异性抗体水平显著高于对照组。32 d的特异性抗体效价为1∶12 800。以上结果表明,目的蛋白能够诱导体液免疫应答产生特异性抗体。

2.2.4中和抗体检测结果 将仔猪血清56℃灭活30 min,稀释倍数从1∶2到1∶2 048,选择首免后32 d的血清,进行中和抗体检测,PEDV-RBD蛋白组中和抗体效价中位值为1∶284,最高效价达1∶512(图4)。

2.2.5仔猪外周血淋巴细胞流式细胞术分析结果 仔猪21 d加强免疫后,32 d采集仔猪血液10 mL,分离淋巴细胞后染色,经流式细胞术分析细胞因子CD3+CD4+、CD3+CD8+双阳性T淋巴细胞所占比例(图5)。结果显示,PEDV-RBD蛋白组细胞因子CD3+CD4+双阳性T淋巴细胞所占比例略高于空载体对照组,显著性高于佐剂对照组;表明目的蛋白可诱导仔猪CD3+CD4+双阳性T淋巴细胞。

A.特异性抗体时间监测;B.特异性抗体效价

**.P<0.001

*.P<0.05;ns.差异不显著

3 讨论

PEDV是导致仔猪腹泻和死亡的主要病原体,患病仔猪死亡率可达100%,对养猪业造成巨大的经济损失[11]。国内上市的针对PEDV的疫苗主要是PEDV和TGEV二价灭活疫苗[12]。瑞普生物公司进行了PED和猪传染性胃肠炎二联活疫苗的中试研究,通过传代和克隆技术纯化致弱病毒,一次免疫即可有效预防PED和猪传染性胃肠炎2种猪腹泻病毒病,具有较高的免疫原性[13]。灭活疫苗安全性好,易于生产,但灭活过程中容易发生突变[14];活疫苗免疫原性高,单次免疫即可诱导较强的免疫应答,但弱毒有返强风险使其使用受限[15]。亚单位疫苗则被视为最安全的疫苗类型,无任何传染性,但有包含保护性免疫反应的基本抗原[16],虽其免疫原性较低,但通过佐剂或免疫增强剂的融合使用可以增强疫苗的免疫原性[17]。

铝盐佐剂是目前应用最广的一种免疫佐剂,主要有氢氧化铝和磷酸铝2种,其中氢氧化铝的使用更广泛。目前认为,铝佐剂的疫苗佐剂效应机制主要有“储存库效应”和“免疫刺激效应”2种。“储存库效应”即铝盐佐剂吸附抗原在接种区域贮存,缓慢释放,延长抗原作用时间,增强体液免疫;“免疫刺激效应”即铝盐佐剂在注射部位吸引大量炎性细胞[18]。添加的铝盐佐剂可以提高疫苗免疫原性,并使抗原缓慢释放,延长抗体保护持续期。CpG基序是未甲基化的寡聚脱氧核苷酸,前期研究发现CpG基序在体外细胞水平上能够促进猪免疫细胞的分裂和生殖[19]。大量学者对CpG促进猪用疫苗的免疫效力进行了研究,证实CpG序列在猪用疫苗上具有广泛的应用前景[20-21]。

本课题组在前期利用杆状病毒表达系统制备了PEDV-RBD重组蛋白[7],本研究对抗原进行定量的基础上,配合铝盐佐剂和CpG序列开展了仔猪免疫原性评价研究。试验结果表明,与空载体和佐剂对照组相比,PEDV-RBD蛋白组特异性抗体和中和抗体水平表现显著性升高,表明重组蛋白有效激发了仔猪的体液免疫。CD4+T细胞可分化为多个亚群,通过分泌细胞因子、趋化因子以及募集靶细胞等在细胞免疫中发挥重要作用,可以帮助清除胞内病原体,调节免疫反应,产生记忆细胞等[22]。流式细胞术分析显示,PEDV-RBD蛋白组仔猪的CD3+CD4+双阳性细胞因子略高于空载体对照组和佐剂对照组,表明重组蛋白能够诱导一定的细胞免疫水平。

综上所述,本研究成功制备了PEDV-RBD重组蛋白,并免疫了仔猪,证明其有良好的免疫原性。这为进一步利用杆状病毒载体制备亚单位疫苗奠定了基础,也为利用昆虫杆状病毒表达系统进行其他冠状病毒蛋白的免疫研究提供了借鉴和参考。