禽白血病髓细胞样瘤细胞的鉴别与误诊分析

何书海,张 晒 ,邢一科,成子强

(1.信阳农林学院 动物科技学院,河南 信阳 464000; 2.山东农业大学 动物科技学院,山东 泰安 271018)

禽白血病是家禽三大肿瘤性疾病之一,该病是由禽白血病病毒(avian leukosis virus,ALV)所诱发。其中,J亚群禽白血病病毒(subgroup J avian leukemia virus,ALV-J)侵害禽类造血前体细胞后可导致其转化为髓细胞样瘤细胞[1]。因此ALV-J诱发的白血病又被称之为禽髓细胞性白血病。由于受到机体内源性ALV的干扰,以及ALV-J感染鸡有间歇排毒的特点[2-3],使用ELISA检测的S/P值有时并不能准确反映实际感染情况[4-5];最近有报道提示A亚群禽白血病病毒(ALV-A)也可以引起禽髓细胞性白血病[6]。上述这些情况使得在临床中要明确该病的类型就变得更为困难,因此需要结合病原检查和病理形态检查进行综合判断。

ALV-J诱导的髓细胞样瘤细胞在形态上主要是异常增殖的带有嗜酸颗粒的中、晚幼粒细胞[7],其与正常的髓系细胞在形态上很相似。由于鸟类的髓系造血细胞经历多个发育阶段,在形态上具有多样性,这也增加了禽髓细胞性白血病的病理形态学诊断难度。研究中也发现,正常鸡的法氏囊和脾脏等器官中存在数量不等的中、晚幼粒细胞,但这种现象并未引起研究人员的注意,也未见相关研究报道。禽白血病髓细胞样瘤细胞与正常髓系细胞的相似性给初涉该领域的兽医病理工作者带来不少困惑,甚至出现禽白血病病原检测结果和病理形态检查结果相矛盾的现象,误诊漏诊现象时有发生。

因此,本研究结合ALV-J人工感染病例和ALV-J自然感染病例的诊断结果,系统观察和分析该病毒诱导的髓细胞样瘤细胞在各组织器官中的形态特点,并与不同分化阶段的正常髓系细胞进行形态比较和鉴别;旨在明确ALV-J诱导的髓细胞样瘤细胞的病理形态特征,并提出减少误诊或漏诊本病的病理形态诊断要点。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器ALV群特异性p27抗原ELISA检测试剂盒(哈尔滨国生生物科技公司,产品批号:HG102200);TRIzolTM试剂(上海碧云天生物技术有限公司,产品批号:R0016);2720 型RT-PCR仪(美国Thermo Fisher公司);KD-3368-VI石蜡切片机(浙江省金华科迪公司);OLYMPUS CHC型光学显微镜(日本OLYMPUS株式会社);MD90 数码成像装置(广州明美公司)。

1.2 自然感染病例部分养鸡场送检的不同批次ALV-J阳性肉鸡、蛋鸡或肉蛋兼用地方品种鸡,临床病理剖检后采集肝脏、肾脏、脾脏、法氏囊等器官备用。

1.3 人工感染病例无特定病原体(SPF)来航鸡6日龄鸡胚(购自济南斯帕法斯公司)尿囊腔内注射100 μL(10-4TCID50/mL)ALV-J病毒(NX0101株)液;对照组鸡胚注射等剂量的DMEM培养基。2组鸡胚分别置于隔离孵化箱中孵育至出壳,孵化后ALV-J感染组(n=30)和对照组(n=30)鸡置隔离罩中饲养。按试验要求对各组鸡进行定期剖检,并采肝脏、肾脏、脾脏及法氏囊等器官备用。

1.4 ALV群特异性p27抗原ELISA检测采集被检鸡泄殖腔棉拭子样本,反复冻融后,800 ×g离心10 min后取上清,ELISA方法检测ALV的p27抗原。检测方法按照ELISA检测试剂盒说明书进行。

1.5 血涂片制备与染色翼下静脉采血,推制成厚薄适宜的血涂片。血涂片在空气中干燥后,用瑞氏染液染色1 min,再加等量的缓冲液与染液混合再染5 min。蒸馏水冲洗多余染液后自然干燥、镜检并摄片。

1.6 ALV-J RT-PCR检测根据 GenBank 中登录的HPRS103 (Z46390.1)的基因序列,设计ALV-J检测引物。引物碱基序列: F:GGATGAGGTGACTAAGAAAG;R:GAACCAAAGGTAACA-CGT,引物由华大基因公司合成。RT-PCR步骤如下:首先取被检鸡的肝脏,按TRIzolTM试剂盒的说明书提取肝脏组织的总RNA;在分光光度计测定 RNA的浓度及纯度符合要求之后,再将所提取的RNA 逆转录为cDNA;然后以cDNA为模板进行RT-PCR扩增(反应体系为25.0 μL:RT-PCR Master Mix 12.5 μL,上、下游引物各0.5 μL,模板DNA 1.0 μL,ddH2O补足25.0 μL。ALV-J的反应程序:95℃ 5 min,95℃ 30 s,51℃ 30 s,72℃ 30 s,30个循环;72℃ 10 min 后置 4℃保存);最后对RT-PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。

1.7 病理组织形态学检查将RT-PCR检测结果呈阳性的临床送检鸡、ALV-J人工感染鸡以及正常未感染鸡的肝脏、脾脏、肾脏、法氏囊等器官置于4%多聚甲醛中固定,然后按常规方法进行石蜡组织切片制片及HE染色。染色后镜检并摄片。

2 结果

2.1 ELISA检测结果ELISA检测结果显示人工感染的ALV-J感染鸡体内ALV p27抗原阳性,对照组鸡体内病毒p27抗原阴性(图1)。另外,在对临床送检病例进行ALV p27抗原ELISA检测时发现部分鸡泄殖腔棉拭子样本p27检测结果呈阳性。

图1 p27抗原ELISA检测结果

2.2 RT-PCR检测结果RT-PCR检测结果显示,在人工感染鸡的肝脏中均有ALV-J的存在(图2)。另外,在临床送检病例中,均以ALV-J的RT-PCR产物阳性结果判定为感染该病毒。

M.DL2000 DNA Marker;1～8.8个被检样本;P.阳性对照;N.阴性对照

2.3 ALV-J人工感染鸡髓细胞样瘤细胞与正常鸡髓系细胞的形态特征

2.3.1石蜡组织切片中髓细胞样瘤细胞形态特征 从鸡胚发育第16天开始,连续观察了ALV-J人工感染鸡脏器中髓细胞样瘤细胞的形态。结果显示,在人工感染ALV-J病例中,最早可在20日龄鸡的肝脏及肾脏观察到髓细胞样瘤细胞(图3A、B)。髓细胞样瘤细胞直径为8～10 μm,胞核约占细胞体积的1/2、偏在、未分叶,瘤细胞胞质中充满粗大的嗜酸颗粒(图3A M),可见病理核分裂象;并可见少数早幼粒细胞,细胞核约占细胞体积的2/3;胞浆内无颗粒(图3A Pr)。

在正常组,鸡胚发育第16天即可在法氏囊和脾脏中观察到处于不同发育阶段的髓系细胞。这些细胞一部分是由来源于骨髓的造血祖细胞(图3C H)定植于法氏囊上皮芽中发育而来的,最终定植于法氏囊间质结缔组织中逐渐分化为髓系粒细胞(图3C G);这些细胞多为晚幼粒细胞,胞核较小,约为细胞的1/3大小,嗜酸颗粒较为细小。另一部分造血祖细胞会逐步分化为淋巴细胞,并形成法氏囊滤泡(图3E Fo)。同时,来源于骨髓的造血祖细胞随血道迁移至脾脏中,最终分化为淋巴细胞与髓系粒细胞(图3D)。在孵化后36 d,正常鸡的法氏囊和脾脏中依然存在大量成熟的嗜酸粒细胞和少量晚幼粒细胞,其大小为5～8 μm(图3E、F)。

2.3.2血涂片中髓细胞样瘤细胞形态特征 因制作石蜡组织切片会造成细胞体积收缩,为明确髓细胞样瘤细胞的实际大小,进一步开展了血涂片检测。血涂片结果显示,上述20日龄ALV-J阳性鸡血液中存在大量的髓细胞样瘤细胞,髓细胞样瘤细胞直径12～14 μm,外观与早幼粒细胞细和中幼粒细胞相似(图4A M)。胞核占细胞体积的2/3～1/2、核偏在、未分叶。部分瘤细胞胞质中充满粗大嗜酸圆形颗粒;另一部分瘤细胞处于分化早期,胞浆内无肉眼可见的颗粒。在对照组正常鸡血液中不存在早幼粒细胞或中幼粒细胞,只有少量的异嗜粒细胞和淋巴细胞,大小7～9 μm(图4B He、Ly)。

2.3.3临床检测病鸡体内髓细胞样瘤细胞形态特征 病理组织学检查结果显示,在送检自然感染病例中,RT-PCR检测结果呈ALV-J阳性的部分病鸡体内存在典型的髓细胞样瘤细胞。这些瘤细胞直径约10 μm,细胞核约占细胞1/2大小、未分叶、偏在,瘤细胞胞质中充满粗大嗜酸圆形颗粒(图5A、B),且可见病理核分裂象。

A.20日龄ALV-J阳性鸡肝脏髓细胞样瘤细胞;B.20日龄ALV-J阳性鸡肾脏髓细胞样瘤细胞;C.16日龄正常鸡胚法氏囊髓系细胞;D.16日龄正常鸡胚脾脏髓系细胞;E.28日龄正常鸡法氏囊髓系细胞;F.28日龄正常鸡脾脏髓系细胞;图中M.髓细胞样瘤细胞;Pr.早幼粒细胞;H.造血祖细胞;G.成熟粒细胞;Fo.法氏囊滤泡

A.20日龄ALV-J阳性鸡血液髓细胞样瘤细胞;B.20日龄正常鸡血细胞;图中M.髓细胞样瘤细胞;He.异嗜性粒细胞;Th.凝血细胞;Ly.大淋巴细胞

在临床检查中发现,ALV-J和ALV-A的病鸡组织器官中存在一些易与髓细胞样瘤细胞混淆的细胞群体。为了与髓细胞样瘤细胞相区别,在此一并描述这些细胞的形态特征。如图5C所示,在肝脏汇管区血管内外可见多数晚幼粒细胞,直径约7 μm,胞核较小、多分叶,胞浆内充满大量嗜酸颗粒。如图5D所示,在肾脏可见大量变性坏死的肾小管上皮细胞,直径为8～10 μm,胞浆深染,胞核浓缩呈深蓝色。如图5E所示,在肠组织固有层与黏膜层交界处散在大量的晚幼粒细胞,直径约7 μm,胞核较小、多分叶,胞浆内充满大量的嗜酸颗粒。如图5F所示,在肾脏间质血管中存在大量的晚幼红细胞,直径约6 μm;细胞呈圆形或椭圆形,胞浆均质红染;胞核居中或偏在,呈圆形或椭圆形。

3 讨论

ALV的检测技术目前包括ELISA、IFA、PCR等,这些方法适用于不同检测目的,各有优缺点[8-9]。运用PCR进行病毒核酸检测虽然更加灵敏和可靠,但对于禽白血病这种典型的肿瘤病来说,病理形态学诊断对该病的诊断和分型依然不可或缺。因为陆续有研究显示ALV-A除了引起经典的禽淋巴细胞性白血病外,还可以诱发禽髓细胞性白血病[6];同样,ALV-J不仅可以引起禽髓细胞性白血病,还可以诱发禽淋巴细胞性白血病[10]。

ALV-J诱导的髓细胞样瘤细胞在形态上主要表现为含有嗜酸颗粒的中、晚幼粒细胞,需与正常鸡组织器官中的髓系粒细胞相鉴别。研究已证实,ALV-J的靶细胞是前髓细胞;ALV-J感染前髓细胞后可整合到细胞基因组DNA,然后利用细胞机制复制合成子代病毒;ALV-J子代病毒可阻滞前髓细胞及髓细胞的发育,最终将其转化为肿瘤细胞,即髓细胞样瘤细胞[11]。在正常鸡的造血组织内,有着一定数量的髓系细胞(又称粒系细胞)。髓系细胞在造血组织中经过前髓细胞(包括原粒细胞、早幼粒细胞)、髓细胞(中幼粒细胞)、后髓细胞(晚幼粒细胞)的演变,最终分化为成熟的粒细胞(异嗜性细胞、嗜酸粒细胞、嗜碱粒细胞)[12]。

本研究发现,在雏鸡的肝脏、脾脏、肾脏以及法氏囊中仍然有数量不等的晚幼粒细胞,这可能与这些器官延续了胚胎期的造血功能有关。因为雏鸡的先天免疫比后天免疫更为发达,且髓系细胞发挥着重要作用[13]。在形态上,这些处于不同发育分化阶段的粒系细胞在形态上与髓细胞样瘤细胞很相似。受制于ALV p27抗原ELISA检测结果的不确定性,以及ALV感染鸡有间歇排毒的特点,如果对鸡正常髓系细胞的发育特点和形态特征认识不足,在诊断禽髓细胞性白血病时很容易将正常髓系细胞误诊为瘤细胞。另外,在鸡具有肝脾肿大等临床特征时,也容易将某些增生的髓系细胞误判为髓细胞样瘤细胞;此时就需要综合病毒核酸检测结果和病理形态学结果共同鉴别诊断。在研究中,RT-PCR检测结果与病理形态学检查结果间表现出了较高的一致性。血涂片中髓细胞样瘤细胞大小最接近真实大小(13 μm左右),而石蜡组织切片中的瘤细胞稍小一些(9 μm左右),这是因为在制作组织切片时,组织细胞会有30%～40%的收缩[14]。

综上所述,诊断禽髓细胞性白血病会受到认识水平、ALV特性以及检测方法等因素的影响;临床上应根据病原学检查和病理学检查结果进行综合分析,防止误诊与漏诊的发生。