基于牛呼吸道合胞体病毒F基因TB GreenⅡ荧光定量PCR检测方法的建立

郭 兵,王海凤,李 妍,张 玥,陈 彪,秦建华*

(1.河北农业大学 动物医学院 农业农村部奶牛健康养殖重点实验室(部省共建),河北 保定 071000;2.河北北方学院 动物科技学院,河北 张家口 075000)

牛呼吸道合胞体病毒(bovine respiratory syncytial virus,BRSV)是世界范围内引起牛呼吸道疾病综合征的重要病原之一,是导致牛下呼吸道感染的首要原因[[1-2]。感染牛临床可见鼻腔和眼睛分泌物渗出、发热、咳嗽、气喘和呼吸困难等症状[3],病死牛剖检可见不可逆性肺损伤如肺水肿、肺气肿和间质性肺炎等病理性变化[4]。牛感染BRSV后,病毒长期存在于体内引起持续感染,使牛的免疫力下降,最终导致牛呼吸道合胞体病暴发[5]。该病发病率高,死亡率低,但受到外界因素(温度、断奶和混群等)刺激死亡率明显升高,给养牛业带来巨大经济损失,是养牛业面临的重大难题[6]。临床上BRSV的一些非典型症状常与牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)和牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)等病原感染引起的临床症状极为相似,给临床诊断带来难度[7],因此建立有效的BRSV检测方法对牛呼吸道合胞病的防控具有重要意义。

国内外已建立的BRSV定量检测方法靶基因均为N基因。韦佳塔等[8]针对BRSV N 基因建立了荧光定量PCR检测方法,UEHARA等[9]建立了针对N基因的液滴-实时荧光定量PCR方法。然而,随着病毒不断发生变异,上述检测技术亦受到了挑战。BRSV F蛋白介导宿主细胞与病毒的融合,增强病毒的穿透力,将核衣壳传递到细胞质中[10],还可以促进受感染细胞和临近细胞的结合进而形成合胞体,诱导机体产生体液免疫应答[11]。F蛋白具有高度的稳定性,不同毒株间的部分序列分析表明核苷酸和氨基酸变异程度分别为0.8%和1.8%[12]。国外早在1994年已有以F基因作为目的基因建立巢氏PCR诊断方法的报道[13],国内史鸿飞等[14]针对BRSV融合蛋白F基因建立了套式RT-PCR方法,但国内、外以F基因建立的检测方法均不能进行定量检测。

综上,本研究针对BRSV F基因高度保守区建立TB Green Ⅱ 荧光定量PCR检测方法,以期增加该病毒检测的候选基因,为牛呼吸道合胞体病的防控提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 病毒cDNA和临床被检样品及主要试剂IBRV cDNA、BVDV cDNA,从鼻拭子、抗凝血和肺脏组织匀浆3种样品中分离鉴定的BRSV cDNA,均由本实验室保存;50份出现明显临床症状疑似感染BRSV病牛的抗凝血、鼻拭子和死亡牛只的肺脏样品采集于河北省高寒地区(张北、尚义和康保县)养牛场;TB Green Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒、pMDTM19-T Vector Cloning Kit和反转录试剂盒购自宝生物技术(北京)有限公司;病毒基因组RNA提取试剂盒购自广州飞扬生物工程有限公司。

1.2 引物的设计与合成参考GenBank中BRSV(M58350.1、MN316656.1、AJ971803.1)核酸序列,选择F基因设计荧光定量PCR特异性引物,引物序列F:5′-AGTTGACACTGTATCCGTTGG-3′;R:5′-ACTCATCGGAAGGAAACA-3′,扩增长度为125 bp,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 重组质粒的制备以BRSV的 cDNA为模板,用设计的特异性引物进行BRSV目的片段扩增;将琼脂糖凝胶回收的目的片段与pMD19-T载体连接后转化至DH5α感受态细胞,重组质粒命名为pMD19T-BRSV-gF;挑取白色单菌落增菌培养后提取质粒,用限制性内切酶XbaⅠ和Sal Ⅰ进行双酶切鉴定(目的基因为125 bp,质粒为2 692 bp);对双酶切鉴定正确的重组质粒进一步做测序鉴定;将上述鉴定正确的重组质粒作为绘制BRSV标准曲线的模板;用酶标仪测定测重组质粒浓度和纯度,计算拷贝数,公式为:拷贝数=质粒浓度×6.02 × 1023×10-9/(660×质粒长度)。

1.4 TB Green Ⅱ荧光定量PCR反应条件优化分别设置51,52,53,54,55,56,57℃作为退火温度优化反应条件,分析扩增曲线,确定最佳退火温度;运用优化后的退火温度,设置0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2 μL 进行引物体积摸索,确定反应的最佳引物量,反应结束后制作熔解曲线。

1.5 荧光定量PCR标准曲线的建立将BRSV重组质粒作10倍梯度稀释,选取6个连续稀释浓度质粒(3.9×101～3.9×106copies/μL)作为模板,每个浓度设3个重复,以ddH2O作为阴性对照,以1.4优化后的反应体系和条件进行荧光定量PCR扩增,反应结束后绘制标准曲线。

1.6 敏感性试验将BRSV重组质粒作10倍梯度稀释,选取6个连续稀释浓度质粒(3.9×101～3.9×106copies/μL)作为模板,每个浓度做3个重复,以ddH2O作为阴性对照,进行荧光定量PCR 扩增,通过观察荧光扩增曲线获得BRSV重组质粒最低检出浓度。

1.7 特异性试验采用建立的荧光定量PCR方法分别对BRSV、BVDV和IBRV 的cDNA进行扩增,同时设ddH2O为阴性对照,通过观察PCR扩增曲线评价所建方法的特异性,被检样品出现典型的“S”型扩增曲线判为阳性,无明显扩增曲线判为阴性。

1.8 重复性试验选取4个连续稀释浓度BRSV重组质粒 (3.9×103～3.9×106copies/μL) 作为模板,用荧光定量PCR方法进行批内和批间重复试验,每个浓度设3个重复,统计Cq 值并计算标准差,通过对变异系数(CV)分析评估所建方法重复性。

1.9 临床样品的检测按照RNA提取试剂盒和反转录试剂盒说明书对50份抗凝血、鼻拭子和肺脏临床样品进行BRSV RNA提取和cDNA 反转录。利用荧光定量PCR方法和常规PCR方法(黑龙江省地方标准,DB23/T)进行BRSV病原检测,比较2种方法的阳性检出率和符合率。

2 结果

2.1 重组质粒的构建构建的重组质粒经XbaⅠ和SalⅠ双酶切后,凝胶电泳得到约125 bp片段,与预期目的基因片段大小相符,且载体片段与理论值相符(2 692 bp)(图1);经BLAST检索,与GenBank中参考序列一致,说明BRSV重组质粒构建成功。重组质粒质量浓度为120.4 mg/L,根据公式计算得出重组质粒拷贝数为3.9×1010copies/μL。

2.2 荧光定量PCR反应条件的优化通过对退火温度和引物体积优化,确定TB Green Ⅱ荧光定量PCR方法反应体系:TB Green Premix Ex Taq Ⅱ (2 ×)10.0 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL,模板2.0 μL,ROX Reference Dye Ⅱ (50×) 0.4 μL,ddH2O 6.0 μL。BRSV熔解曲线温度为83℃,最佳扩增条件:预变性95℃ 30 s;95℃ 5 s,55℃ 34 s,共40个循环(图2)。

M.DL2000 DNA Marker;1.pMD19T-BRSV-gF双酶切产物;2.阴性对照

A.51～57℃退火温度时的扩增曲线;B.51～57℃退火温度时的融解曲线;C.上、下游引物各0.8 μL时的扩增曲线;D.上、下游引物各0.8 μL时的融解曲线;红色箭头.最优条件

2.3 荧光定量PCR标准曲线的建立以梯度稀释的BRSV重组质粒为模板,进行荧光定量PCR扩增,建立标准曲线(图3)。重组质粒模板拷贝数在3.9×101～3.9×106copies/μL范围内,与Cq值呈现良好的线性关系。标准曲线斜率为-3.256 1,相应的回归方程为y=-3.256 1x+32.338 0,相关系数R2=0.995 2,扩增率为103%。

图3 荧光定量PCR标准曲线

2.4 荧光定量PCR敏感性试验选取6个连续稀释浓度质粒(3.9×101～3.9×106copies/μL)为模板进行荧光定量PCR扩增,BRSV重组质粒出现良好的S型荧光扩增曲线,阴性对照组无扩增曲线,BRSV重组质粒的最低检出浓度达3.9×101copies/μL(图4)。

1～6.质粒浓度依次为3.9×101～3.9×106 copies/μL;7.阴性对照

2.5 荧光定量PCR特异性试验利用建立的荧光定量PCR方法对IBRV、BVDV和BRSV的cDNA进行检测,从鼻拭子、抗凝血和肺脏组织匀浆3种样品中分离出的BRSV cDNA 均扩增出典型的“S”型扩增曲线,IBRV cDNA、BVDV cDNA和阴性对照均无特异性扩增(图5)。

1.鼻拭子BRSV扩增曲线;2.肺脏组织匀浆BRSV扩增曲线;3.抗凝血BRSV扩增曲线;4.BVDV扩增曲线;5.IBRV扩增曲线;6.阴性对照组扩增曲线

2.6 荧光定量PCR重复性试验用荧光定量PCR方法对4个浓度(3.9×103～3.9×106copies/μL)的BRSV重组质粒进行批内和批间重复试验(表1),批内Cq 值的CV为0.7%～1.9%,批间Cq 值的CV为0.9%～1.8%,均小于2.0%。

2.7 临床样品检测用建立的荧光定量PCR方法和常规PCR方法对50份临床样品进行检测,荧光定量PCR对BRSV的阳性检出率为26%(13/50),常规PCR阳性检出率为14%(7/50),2种方法总符合率为88%(44/50),阳性符合率为100%(7/7),阴性符合率86%(37/43) (表2)。

表1 荧光定量PCR重复性试验

表2 临床样品检测结果

3 讨论

荧光定量PCR技术利用荧光信号的变化实时监测PCR反应过程,通过标准曲线对未知模板进行定量分析。该技术灵敏性较高,特异性较强,近年来广泛应用于畜禽病原的检测[15-16]。常用的荧光定量PCR方法有荧光标记探针法和荧光染料法,探针法需要合成探针,费用昂贵;染料法无需合成探针,操作简单,检测成本较低,临床应用更为广泛。TB Green Ⅱ荧光染料对双螺旋DNA的结合高度专一,能很好地抑制cDNA中残存的mRNA活性,避免mRNA对PCR反应的影响,是常用的一种荧光染料。

因此,本研究以TB Green Ⅱ为荧光染料,选择BRSV 的F基因设计特异性引物,通过优化反应体系和反应条件,成功建立荧光定量PCR方法。特异性试验中选择临床症状容易混淆的BVDV和IBRV作为阳性对照,结果显示在肺脏组织匀浆、鼻拭子和抗凝血3种样品中均特异性检测出BRSV,BVDV和IBRV检测均为阴性,说明本方法对BRSV特异性较高。批内和批间重复性试验的CV均小于2%,该方法具有良好的重复性和可操作性。本研究建立的荧光定量PCR检测方法对BRSV的最低检测限可达3.9×101copies/μL,与赵毅[17]建立的荧光定量PCR检测方法(BRSV最低检出限为1.02×102copies/μL),姜晓霞等[18]建立的实时荧光定量PCR方法(BRSV最低检出限1.02×102copies/μL)和魏硕佟等[19]建立的BRSV多重PCR方法(BRSV最低检测限1.0×104copies/μL)相比,敏感性更好,分别提高了2.5,2.5,256.4倍。采用荧光定量PCR和常规PCR方法对50份采集样品进行检测,结果显示荧光定量PCR 对BRSV阳性检出率(26%)明显优于常规PCR(14%),阳性符合率为100%,能够满足BRSV临床检测的要求。

综上所述,本研究建立的荧光定量PCR检测方法可应用于临床检测中,为临床上选择合适的BRSV检测方法提供参考以及对牛呼吸道合胞体病的流行病学调查和防控提供技术支持。