内网质应激反应:调控天然免疫信号传导抵御病毒感染的枢纽

曹宏伟,张柯慧,李淑红,仇华吉,李 素

(中国农业科学院 哈尔滨兽医研究所 兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江 哈尔滨150069)

内质网(endoplasmic reticulum,ER)是一种专门用于合成、折叠和分泌跨膜蛋白质的细胞器[1]。内质网管腔富含钙,其氧化环境催化蛋白质的修饰,如添加N-连接聚糖进行糖基化修饰以及形成二硫键进行蛋白折叠,这一过程几乎对于每一种分泌蛋白和膜受体的产生都是必不可少的,因此内质网是控制细胞生物学各个方面的一个重要枢纽,涵盖细胞信号转导途径的各个方面[2]。当细胞受到各种强烈的刺激因素(营养缺乏、Ca2+代谢失衡、毒素刺激、持续的氧化应激等)刺激时,细胞内稳态会被打破,细胞会启动一系列的自我保护反应,包括内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)[3]。ERS会激活3种内质网相关反应:未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)、内质网过载反应(endoplasmic reticulum overload response,EOR)和固醇调节反应,帮助清除内质网中积累的未折叠和不正确折叠的蛋白,恢复内质网的稳态[4]。ERS通过激活UPR,一方面,促进蛋白质的再折叠和降解;另一方面,可以减少蛋白质的生成,最终恢复内质网的稳态[5]。同时有文献报道,内质网可通过自噬作用恢复内质网的正常功能,甚至可恢复整个细胞的正常功能。因此,ERS反应是一个高度可控的过程,能够适应特定的刺激,从而优化和协调适当的反应,维持细胞内稳态。

近年来研究发现,病毒感染激活天然免疫反应,同时诱导ERS的产生,如乙型肝炎病毒(hepatitis b virus,HBV)、丙型肝炎病毒(hepatitis c virus,HCV)、人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)和新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)。HBV感染HepG2细胞诱导表达ERS,分子伴侣BiP被释放,促进干扰素表达发挥抗病毒作用,以维护细胞内稳态[6]。本实验室对非洲猪瘟病毒感染的猪肺泡巨噬细胞进行单细胞转录组分析发现,在高病毒载量的细胞中UPR及ISG基因的转录水平均明显下降[7]。克里米亚-刚果出血热病毒(Crimean-Congo hemorrhagic fever,CC-HFV)感染诱导ERS,通过线粒体通路介导Caspase-9活化调控下游的Caspase-12裂解,诱导肝脏细胞凋亡[8]。在与病毒的军备竞赛过程中,宿主细胞展现出不同的命运,这通常与ERS和天然免疫之间的交互调控密不可分[9]。本综述主要对ERS的主要蛋白质与天然免疫信号通路的交互调控以及ERS诱导的细胞凋亡等方面进行了归纳和总结,以期为进一步研究抗病毒感染提供新的思路。

1 病原感染诱导ERS激活UPR

1.1 UPR的激活到炎症反应不同的应激原,包括病毒感染,都会导致细胞中积累未折叠蛋白,诱导ERS。真核细胞主要通过激活UPR,用以恢复内质网稳态和降低整体蛋白质的合成,来纠正ERS的状态。内质网管腔内的蛋白质负荷和质量主要由UPR 3条分支调控:肌醇依赖内质网至细胞核信号激酶1(IRE1),类RNA依赖蛋白激酶内质网激酶(PERK)以及转录激活因子6(ATF6)(图1)。IRE1是内质网中一种跨膜核糖核酸酶,介导XBP1 mRNA的转录后非规范剪接,该mRNA定位于内质网,并编码一种转录因子,参与上调其他的应激反应基因。此外,IRE1的核酸酶活性在称为IRE1依赖性衰变(RIDD)的过程中参与内质网相关RNA的降解;PERK是一种内质网驻留的跨膜激酶,当感受到ERS时激活,PERK寡聚并磷酸化自身和翻译起始因子eIF2α,间接失活eIF2并抑制mRNA翻译;ATF6是一种转录因子,在未折叠蛋白质积累后,它被包装成运输囊泡,被输送到高尔基体。在那里,它遇到2种蛋白酶S1P和S2P,它们分别去除其管腔结合区域和跨膜锚定区域,释放出含氨基端胞质片段ATF6(N),随后进入细胞核激活UPR靶基因。作为是ERS传感器,IRE1、PERK和ATF6主要用以响应ERS,同时它们也可以与炎症信号分子中间体结合,如IRE-1与TRAF2或STING结合,用以诱导促炎性细胞因子的表达[10-11]。除此之外,UPR相关的转录因子(例如ATF4、ATF3或XBP1)可以直接激活部分细胞因子的转录,甚至PRRs配体的产生都具有一定的UPR依赖性[22]。

正常情况下,内质网内腔与BiP的相互作用抑制IRE1、ATF6和PERK的激活[12]。在ERS期间,错误折叠蛋白质的积累会促使传感器从分子伴侣BiP束缚中释放出来,发生二聚化或激活下游信号级联反应。此外BiP通过改变其亚细胞定位和稳定性,影响炎症反应。在癌症和病毒感染中,BiP的分布发生了改变,其在血流中的异常释放可诱导调节性髓样细胞的产生和促炎性细胞因子的表达,表明UPR似乎有能力独立于其他免疫途径来诱导炎症反应[13]。在持续的免疫反应中,反复激活会诱导形成一个正反馈回路,这会持续产生促炎性细胞因子,并最终导致慢性疾病的发生,如动脉粥样硬化或糖尿病[14]。

IRE1.肌醇依赖内质网至细胞核信号激酶1;PERK.类RNA依赖蛋白激酶内质网激酶;ATF6.转录激活因子6

1.2 UPR介导的ERS适应机制UPR通过减少蛋白质的合成、诱导分子伴侣的表达、激活内质网相关降解(ER-associated degradation,ERAD)以及抑制细胞周期G1期来降低内质网的负荷,从而促进细胞的修复[15]。在这些条件下,细胞周期蛋白D1会迅速降解,细胞周期进入停滞,细胞稳态得以恢复。然而尽管大多数蛋白质翻译受到抑制,但某些转录因子的翻译却是增加的,如上调了转录因子ATF4的翻译。ATF4诱导和参与了氨基酸代谢、抗氧化应激反应和分泌蛋白质的表达,来促进细胞稳态的恢复[16]。此外,ATF4诱导C/EBP同源蛋白CHOP的表达,CHOP是转录因子的一种,参与ERS诱导的细胞凋亡、内环境稳态恢复以及上调GADD34表达等过程[17]。GADD34是蛋白磷酸酶1(PP1)的激活剂,可使磷酸化的eIF2α去磷酸化。通过这种方式,GADD34促进翻译的恢复,进而帮助细胞恢复正常功能[18]。

ATF6有2种亚型,ATF6α和ATF6β,它们都是合成内质网跨膜受体的重要转录因子,并且在ERS期间都通过相同的机制被激活[19]。当BiP从内质网管腔分离,ATF6α被运输到高尔基体,在此被蛋白酶水解后释放,随后转移到细胞核以激活基因表达[20]。ATF6α与含有ERS反应元件的启动子结合,促进内质网伴侣蛋白和参与ERAD的蛋白质合成,来反式激活ERS反应[21]。通过这些手段,ATF6α的激活有助于细胞处理积累的未折叠蛋白质。IRE1的2种亚型IRE1α和IRE1β在肠道细胞中被发现[22]。研究发现,IRE1α是一种多功能分子,含有1个激酶结构域和1个C端核糖核酸酶结构域[23]。而IRE1α的激活与其激酶结构域寡聚化和磷酸化有关,但其主要的稳态信号输出则来自核糖核酸酶结构域,该结构域特异性地从未拼接或全长XBP1 mRNA中移除1个内含子,以生成spliced XBP1(XBP1s)。XBP1s是一种高度活跃的转录因子,是调节内质网折叠能力的关键因子之一,XBP1s激活不仅可以增强内质网折叠蛋白能力,还能促进错误折叠蛋白的降解[24-25]。因此,UPR作为一种重要的适应机制,使内质网折叠能力与蛋白质需求相匹配。

1.3 UPR介导的细胞死亡信号通路早期研究发现,内质网持续应激会诱导细胞凋亡,但目前尚不清楚具体的作用机制(表1)。一些研究表明,内质网上的半胱氨酸蛋白酶与细胞凋亡有关,在细胞凋亡过程中Caspase-12或Caspase-4和Caspase-7移位到内质网[26]。但在大多数人类细胞中,Caspase-12存在多个失活突变体,因此ERS诱导的人类细胞系凋亡可能不需要Caspase-12和Caspase-4的参与[27]。进一步研究发现,缺失-凋亡蛋白酶激活因子1(APAF-1)-小鼠成纤维细胞(MEF)对ERS的敏感性不变,这表明,ERS诱导的细胞凋亡不依赖APAF-1[28]。因此,现在人们普遍认为ERS主要通过线粒体通路介导Caspase-9活化调控下游的Caspase-12裂解,诱导细胞凋亡。关于ERS与线粒体之间具体作用机制尚不清楚,现将已有的猜想进行讨论和分析。

内质网释放的Ca2+可能触发细胞凋亡,定位于内质网上的促凋亡B细胞淋巴瘤-2(BCL-2)家族蛋白成员BAX和BAK被证明能够触发Ca2+释放[29]。而且BAX和BAK与IRE1之间存在相互作用,这进一步表明,其与ERS诱导的细胞凋亡有关。此外,酪氨酸激酶c-ABL通过PKCδ介导的磷酸化从处于应激状态的内质网传递到线粒体以诱导细胞凋亡,而定位于高尔基体或内质网的Caspase-2也与ERS诱导的细胞凋亡有关,但作用机制尚不清楚,可能与Caspase-2切割BCL-2同源结构域3(BH3)-蛋白BID激活内在凋亡途径有关[30]。尽管所有这些因素可能都有助于ERS诱导的细胞凋亡,但促凋亡信号主要由ERS受体IRE1、PERK和ATF6发出,这些信号能直接或间接地调节BCL-2家族的蛋白质以促进线粒体外膜通透性,从而激活Caspase和内在的凋亡途径。

表1 病毒感染激活宿主天然免疫反应和ERS

PERK介导的eIF2α磷酸化导致蛋白质合成停止,可能诱导细胞凋亡。有证据表明,eIF2α磷酸化后由ATF4介导的转录因子CHOP上调。此前研究表明,CHOP参与ERS诱导的细胞凋亡,CHOP敲除的MEF细胞能有效抑制ERS诱导的细胞凋亡[36]。CHOP可下调抗凋亡BCL-2的转录以及上调促凋亡蛋白BIM的表达,BIM是ERS诱导细胞凋亡的介质[37]。在研究癌症细胞中发现,CHOP介导促凋亡受体DR5的上调,在ERS期间细胞对凋亡敏感[38]。这表明,CHOP控制与细胞凋亡途径直接相关的蛋白质的表达。ATF6一直被认为仅在ERS中履行自适应功能,其与ERS诱导的凋亡的唯一交叉可能是在调控CHOP表达中发挥作用[39]。然而,另一研究表明,ATF6可间接下调成纤维细胞中抗凋亡的BCL-2家族成员MCL-1,表明在ERS中ATF6可能触发细胞凋亡[40]。IRE1的活化与肿瘤坏死因子受体相关因子2(TRAF2)具有相互作用[41]。据报道,这种相互作用促进了一系列涉及丝裂原活化蛋白激酶(MAP3K)凋亡信号调节激酶1(ASK1)的磷酸化事件,并最终诱导活化蛋白-1的复合物c-JUN-N-末端激酶(JNK)激活[42]。敲除或敲低ASK1细胞可抑制ERS诱导的细胞凋亡,这也突出了IRE1-ASK1-JNK通路在这些细胞中的重要性[43]。总之,UPR介导的细胞死亡信号通路在ERS诱导的细胞凋亡中发挥着重要的作用。

2 ERS对天然免疫的调控

2.1 天然免疫途径和UPR信号通路天然免疫途径和UPR途径具有相似性。IRE1和TLR都能触发ROS和急性期蛋白的生成,并且都能与NEMO和TRAF适配器结合,从而触发炎症信号成分,如NF-κB、MAPK和JNK[44]。此外,IRE1和PERK在进化上与参与天然免疫的蛋白质有关。RNase L是一种抗病毒感染的胞质激酶,激活后促进病毒RNA的降解,降解产物会诱导Ⅰ型干扰素和天然免疫通路的激活,包括RIG-I/MAVS通路[45]。同样,哺乳动物中PERK与PKR等抗病毒效应因子存在相互作用。PKR是一种作用较强的抗病毒蛋白,可感知双链RNA并介导Ⅰ型干扰素反应[46]。IRE1和PERK与已知的天然免疫调节器之间的相似性表明,天然免疫激活途径和ERS信号通路使用的一些共同信号转导途径以响应特定的应激和损伤。

2.2 ERS响应病原感染为了建立自己的生态位并进行复制,细胞内病原体已经进化到可以与包括ER在内的特定细胞器发生相互作用。在病毒感染过程中,病毒产生大量的病毒蛋白并在ER腔内积累。一些病毒,如HCV和登革热病毒(Dengue virus,DENV),使用ER作为它们的复制位点。这些病毒活动经常破坏内质网的内稳态,引起ERS,从而导致多种常见病,如神经退行性疾病、肾脏疾病、肝脏疾病、眼部疾病和癌症,并且表现出ERS和炎症的特征,包括UPR反应、中性粒细胞和巨噬细胞浸润以及急性期蛋白的增加等[47]。此外,XBP1已被证明在炎症性肠病和Ⅱ型糖尿病中发挥作用,表明ERS触发特定的UPR信号通路来促进炎症反应[48]。

此外,对于当前大流行的严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2),报道了冠状病毒感染激活ERS信号,并在mRNA水平诱导UPR组件的转录,而在蛋白水平抑制它们的表达[33]。已知冠状病毒可以激活NF-κB、JNK和p38 MAPK通路,并调控宿主细胞转录组[49]。此外,它们诱导了复制细胞器(replicative organelles,ROs)的形成,其含有病毒复制/转录复合物,并保护这些复合物不被细胞防御机制识别[50]。虽然用于形成ROs的膜的起源仍然存在争议,但至少可以部分地联系到ERS和自噬相关过程。正如HCoV-229E17感染细胞的报道,病毒诱导的细胞变化与UPR激活有关[51]。

2.3 UPR信号通路调节天然免疫天然免疫应答在ERS出现后增强,可能的解释是UPR信号通路的组成部分涉及天然免疫下游受体。因此,ERS期间这些途径的过度激活可能促进天然免疫反应的活化。在检测不到ERS的情况下,TLR4和TLR2也能特异性地促进内质网信号激酶IRE1的磷酸化及其下游靶分子XBP1的激活[52]。有趣的是,病原体和TLR只激活IRE1不会促进其他内质网信号通路的激活[53]。相反,TLR激活的XBP1是巨噬细胞持续产生促炎性细胞因子所必需的。这种特异性作用也可能揭示了其他转录调节因子对TLR介导的免疫反应或具有调节XBP1活性的ER信号通路的影响。对敲除XBP1小鼠的研究强调了XBP1在非应激巨噬细胞中的作用,缺乏XBP1的禽类细胞感染由TLR3介导的NDV后显著抑制了促炎性细胞因子TNF-α的表达[34]。这些研究揭示了在ERS的情况下,内质网信号通路的特定分支可直接被天然免疫信号通路使用。

口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)感染幼鼠肾细胞(BHK-21)和猪肾脏细胞(PK-15)时PERK和ATF6被激活,IRE1α-XBP1信号通路则被抑制,表明FMDV主要通过拮抗IRE1α/RIG-Ⅰ途径来规避宿主抗病毒防御机制[32]。在另一个研究中,感染寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)的上皮细胞中ZIKV 激活IRE1α剪接XBP1 mRNA,同时发现ZIKV诱导人神经干细胞中XBP1特异靶基因表达上调[35]。这表明,病毒感染通过定向激活内质网信号通路来调控细胞的天然免疫。

研究表明,病毒感染能重新定向ERS反应,以增强内质网信号通路,从而驱动炎症,同时下调其他途径[54]。令人惊讶的是,未经治疗的丙型肝炎患者的肝脏细胞出现ERS,并诱导IRE1、ATF6和PERK的激活,而没有明显诱导参与UPR反应基因的表达,相反参与炎症和凋亡的基因被显著表达[55]。UPR相关基因表达的缺乏可以解释为IRE1下游受到HCV的抑制作用,或者天然免疫系统主动抑制ERS反应的特定分支将应激反应转向炎症反应。同样的现象可以解释细菌和寄生虫触发内质网信号通路激活,却只激活少数参与UPR反应的基因表达,这表明,UPR中的ATF4-CHOP分支被TLR信号特异性抑制[56]。此外,在巨噬细胞中TLR信号可抑制ATF6和PERK活性。虽然抑制特定的内质网信号通路的机制尚不清楚,但研究表明,在存在病原感染的情况下,天然免疫具有协调内质网信号反应的能力。

天然免疫反应同样可以积极调节由ERS引起的生理变化。抗病毒蛋白PKR已被证明对ERS和营养信号有反应,以调节胰岛素的代谢,并且是ERS时激活JNK所必需的,这进一步证明内质网信号和天然免疫途径是显著互联的,可以相互调节。

3 展望

作为抗病毒感染的第一道防线,天然免疫一直都是研究的焦点。越来越多的研究表明UPR反应与天然免疫有着密切的联系,确定了UPR信号通路的组成部分涉及天然免疫下游受体,诸如PERK-eIF2α-ATF4免疫信号传导通路,同时明确UPR激活后,将会增强机体的天然免疫应答反应。

而近期在猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRSV)研究方向上的新进展,揭示了PRRSV劫持宿主细胞UPR通路促进病毒复制的分子机制,进一步表明在病毒感染中,UPR是决定宿主细胞命运的关键因素。

此外随着对天然免疫信号通路深入研究发现,在病毒感染的情况下,细胞器的形态和功能都会发生变化,而这种变化自然也会影响到细胞器互作,并且天然存在的细胞器之间也必然存在互作,用于各细胞器间进行物质、能量和信号传递。因此对于细胞器稳态的维持不会仅受到单个细胞器调控,而是将会处于多个细胞器的共同调控。研究结果表明,ER和线粒体稳态受到多种细胞器的调控,甚至可能可以跨细胞进行,而这些事情的发生并不违背目前已知的自然规律,通过信号的传递是有可能实现这一点。因此,了解并掌握ER稳态维持的调控机制,对于进一步解析ERS调控天然免疫信号传导抵御病毒感染的分子机制是至关重要的。