基于GEO 数据库及网络药理学探讨扶正化瘀胶囊抗肝纤维化作用机制

陈松鹤 王 燕 龚雯婷 陈 烨 虞 听

肝纤维化是由于各种原因引起的慢性肝损伤在创面愈合过程中，肝细胞再生、胶原活化和细胞外基质过度沉积导致的结果[1]，属于病理学的概念。肝纤维化可进一步发展成为肝硬化、肝癌，甚至导致死亡。针对肝纤维化病因治疗后，肝纤维化是可逆转的，但临床上并未有相应的化学药物[2]。肝纤维化中医上属于“积聚”“胁痛”“癥瘕”范畴，病机主要责之于正虚、湿热、痰瘀、浊毒为主。中医药在该病治疗上其有独特优势，中成药是诸多中医治疗的一种，相较于传统中药汤剂具有免煎便捷，口感良好的优点。近年来，扶正化瘀胶囊作为治疗肝纤维化的中成药之一，临床上多为疗效研究，但对其作用机制的探索较少。本研究通过GEO 数据库差异基因分析联合网络药理学及分子对接验证的方法对扶正化瘀胶囊抗肝纤维化的机制进行初步探讨，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 肝纤维化差异性基因的筛选 运用GEO 数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo），以“liver fibrosis”为检索词检索并下载与肝纤维化相关的基因表达谱数据，利用R 软件对下载数据进行处理，以P＜0.05 且|logFC|≥1.5 为条件筛选差异表达基因，并绘制热图和火山图。

1.2 扶正化瘀胶囊有效成分与靶点筛选 运用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，https://tcmsp-e.com/），以“丹参、冬虫夏草、桃仁、松花粉、绞股蓝、五味子”6 种中药为检索词，设定口服生物利用度（OB）≥30%及类药性（DL）≥0.18 为筛选条件，筛选出扶正化瘀胶囊的主要有效成分和对应靶点。

1.3 扶正化瘀胶囊有效成分对应靶点标准化处理利用Uniport（https://www.uniport.org/）数据库和Perl工具将已筛选的扶正化瘀胶囊主要有效成分对应的靶点进行标准化处理转换成对应的基因名。

1.4 “中药-成分-靶点”调控网络模型的构建 利用Cytoscape 3.9.0 软件对扶正化瘀胶囊中各中药、成分、靶点进行可视化处理，构建“中药-成分-靶点”中药调控网络图。

1.5 蛋白互作网络构建及核心靶点蛋白的筛选 利用STRING（https://string-db.org/Version 11.0）数据库对扶正化瘀胶囊作用于肝纤维化的潜在靶点进行分析，限定人种为“Homo sapiens”，构建蛋白互作网络PPI，最低互动评分设置0.04，导出PPI 网络图和TSV 文件。将导出的TSV 文件导入Cytoscape 3.9.0构建网络，通过CytoNCA 插件分析并筛选出核心靶点蛋白。

1.6 基因本体（GO）功能富集分析与京都基因和基因组百科全书（KEGG）通路分析 将药物与疾病的共同靶点导入DAVID（https://david.Ncifcrf.gov/）数据库，利用R 软件进行GO 和KEGG（P＜0.05）信号通路富集分析，并绘图以可视化。

1.7 分子对接 选取PPI 网络筛选出核心靶点蛋白对应的有效成分，在PubChen、PDB 数据库下载小分子配体和受体蛋白，运用AuToDockTool、Vana 软件进行的分子对接，并通过PyMol 软件进行可视化。

2 结果

2.1 肝纤维化差异基因 从GEO 数据库搜索筛选得到基因芯片GSE197112，包括4 个肝纤维化患者样本（GSM5909322、GSM5909323、GSM5909324、GSM 5909325）和4 个正常的样本（GSM5909318、GSM590 9319、GSM5909320、GSM5909321）。通过R 软件以“P＜0.05 且|logFC|≥1.5”对所得基因进行差异分析，得到差异性基因8478 个，上调基因4252 个，下调4225 个，并绘制热图及火山图（见图1A-B）。图1A中左侧为正常组，右侧为肝纤维化组，红色为高表达，绿色为低表达，黑色为无差异。图1B 中火山图中左侧绿色区域为下调基因，右侧红点区域为上调基因，黑色区域为无差异。

图1 A 为正常组与肝纤维化组差异基因热图；B 为正常组与肝纤维化组差异基因火山图；C 为“中药-成分-靶点”调控网络；D为蛋白互作网络

2.2 扶正化瘀胶囊有效成分及靶点基因的获取 通过TCMSP 平台以OB≥30%及DL≥0.18 为筛选条件，得到丹参成分65 种，靶点2567 个；冬虫夏草成分7 种，靶点384 个；桃仁成分23 种，靶点342 个；松花粉成分2 种，靶点157 个；绞股蓝成分24 种，靶点623 个；五味子成分8 种，靶点995 个。通过Uniport 数据库和Perl 工具将扶正化瘀胶囊的有效成分对应靶点进行标准化处理转换成Gene Symbol，去重后得到有效靶点基因1261 个。

2.3 “中药-成分-靶点”调控网络构建 运用Cytoscape 3.9.0 软件将扶正化瘀胶囊的“中药-成分-靶点”进行可视化展示，建立中药调控网络（见图1C）。图中共有135 个节点，262 条边，外圈为扶正化瘀胶囊的中药成分，中间红色区域为潜在靶点，其中degree 数值越大，图形越大，颜色越深，通过节度值分析参与调控的主要成分有槲皮素、木犀草素、山柰酚、丹参酮ⅡA 等。

2.4 PPI 网络构建与核心靶点的筛选 利用STRING 数据库分析潜在靶点基因，以“minimum required interaction score≥0.04”为条件构建蛋白相互作用网络（见图1D）。图中共有67 个节点，368 条边，平均节点数为10.1。通过PPI 所得TSV 文件导入Cytoscape 3.9.0 构建网络，运用CytoNCA 插件进行分析，分别以betweenness centrality（BC）、closeness centrality（CC）、degree centrality（DC）、eigenvector centrality（EC）、LAC 大于等于中位数为过滤条件进行筛选，最终得出MMP9、CASP3、IL1B、CCL2、MYC、ESR1、VEGFA、CDKN1A、RELA 共9 个核心靶点，35条边，见图2。

图2 核心靶点的筛选

2.5 GO 与KEGG 富集分析 将扶正化瘀胶囊与肝纤维化交集的67 个的靶点基因进行GO 和KEGG富集分析。GO 富集分析分别从生物过程（BP）、细胞成分（CC）、分子功能（MF）三个方面进行分析并选取前10 的条目，KEGG 富集分析选取靠前的30 个条目。GO 富集结果显示生物过程可能与对异物刺激、活性氧及代谢过程、氧气水平、类固醇激素的、脂多糖等的反应有关；细胞成分方面可能与细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶全酶复合物，丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶复合物，膜筏，染色体区域等有关；分子功能方面可能与类固醇激素受体活性，核受体活性，配体激活的转录因子活性，转录共激活因子结合，转录共调节子结合，DNA 结合转录因子结合等有关（见图3A）。KEGG 富集分析结果共涉及36 条通路，见图3B。

图3 A 为GO 功能富集分析；B 为KEGG 通路富集分析

2.6 分子对接验证 选取PPI 网络中筛选的核心靶点蛋白中靠前的MMP9、CASP3、CCL2 和IL1B 与对应的有效成分quercetin（槲皮素）通过Vana 与PyMol软件进行分子对接处理。四者的最低的结合能分别为-7.2、-6.8、-7.4 和-10 kcal/mol，提示四者均具有较好的的结合活性和稳定的结合构象，见图4。

图4 槲皮素与靶点蛋白分子对接验证

3 讨论

本研究通过GEO 数据库差异基因分析联合中药网络药理学及分子对接验证的方法初探扶正化瘀胶囊抗肝纤维化的作用机制，通过构建“中药-成分-靶点”调控网络的节度值分析扶正化瘀胶囊参与调控的主要成分有槲皮素、木犀草素、山奈酚、丹参酮ⅡA 等。研究表明，槲皮素具有保肝和抗纤维化作用，其机制可能与通过调节TGF-β1/Smads 和PI3K/Akt 通路之间的串扰来减弱肝星状细胞活化和减少自噬有关[3]。木犀草素能有效减轻肝纤维化[4]，同时降低丙氨酸氨基转移酶和天冬氨酸氨基转移酶水平[5]。山奈酚作为一种黄酮类产物能显著降低坏死性炎症评分和胶原沉积肝组织，改善肝纤维化形成[6]。丹参酮ⅡA 是丹参的主要成分，广泛应用于肝病治疗当中。肝星状细胞的活化是肝纤维化的主要事件，丹参酮ⅡA 能抑制血管紧张素Ⅱ以抑制肝星状细胞的增值，从而对肝纤维化具有预防和治疗作用[7]。蛋白互作网络显示共有67 个节点，368 条边，并运用CytoNCA 插件分析得到MMP9、CASP3、IL1B、CCL2、VEGFA 等核心靶点9 个。MMP9 是基质金属蛋白酶，MMP9 在纤维化消退中起着关键作用[8]。CASP3 是一种细胞凋亡相关半胱氨酸肽酶，支持肝细胞CASP3的激活在非酒精性脂肪性肝炎相关细胞凋亡、纤维化中起着重要作用，CASP3 的失活能防止肝细胞死亡，并改善肝纤维化[9]。IL1B 基因在HBV 引起的慢性肝脏炎症的发病机制中起重要作用，并被认为可能会增加NASH 的易感性并赋予肝实质损伤的更高风险[10]。CCL2 可能是联系肝脏炎症、纤维化、血管新生这三个关键病理环节的纽带。杨萍等[11]研究表明，CCL2 具有促进HSC 活化及肝纤维化进展的作用。VEGFA 可通过被抑制减少HF 的病理性血管生成以减轻肝纤维化。综上所述，扶正化瘀胶囊抗肝纤维化具有多成分、多靶点的特点[12]。

GO 富集分析显示，生物过程可能对异物的刺激、活性氧及代谢过程、氧气水平、类固醇激素、脂多糖等反应有关。许多不同的药物和外源性物质可损伤胆管上皮并引起炎症性胆管疾病[13]。氧化应激（OS）介导了纤维化的进展，并且OS 相关分子可能充当与肝纤维化有关的分子和细胞事件的介质。活性氧的产生在肝损伤和肝纤维化发生中起重要作用，能诱导肝细胞坏死和凋亡，并放大炎症反应。活性氧还刺激Kupffer 细胞和循环炎症细胞产生促纤维化介质，并直接激活肝星状细胞导致纤维化[14]。许多类固醇激素通过微调与脂质合成、输出和代谢相关基因的表达，成为脂质稳态的重要调节剂[15]，故通过调节类固醇激素水平可作为潜在预防NAFLD 的干预措施。分子功能方面可能与类固醇激素受体活性，核受体活性，配体激活的转录因子活性，转录共激活因子结合，细胞因子受体结合，转录共调节子结合，DNA 结合转录因子结合等有关。研究表明，某种FXR 激动剂如BAR704 能通过干扰肝星状细胞中的TGFβ-SMAD3 通路，增加短异二聚体伴侣（SHP）的转录并诱导该核受体与SMAD3 的结合，从而消除磷酸盐的结合以减少肝纤维化[16]。相互连接的转录因子网络不仅促进了肝细胞功能障碍，而且还引导了NASH 和纤维化进展所需的肝内串扰[17]。

KEGG 富集分析靠前的通路最可能与AGERAGE 信号通路在糖尿病并发症中的作用，TNF 信号通路，流体剪切应力和动脉粥样硬化，IL-17 信号通路，NF-κB 信号通路脂质和动脉粥样硬化等有关。研究表明，AGEs-RAGE 轴在肝损伤和NAFLD 发病机制中起着重要作用[18]，若晚期糖基化终产物（AGEs）的增加，能诱导的肝星状细胞通过自噬激活导致丙型肝炎相关纤维化[19]。肿瘤坏死因子（TNF）-α与肝纤维化有关，具有肝毒性，胆汁淤积产生的TNF-α 可通过HSC 产生TIMP-1 促进肝纤维化[20]。IL-17 是一种促炎症因子，在诸多肝病尤其是在肝纤维化的进展中起着重要作用。高脂肪饮食和高乳脂快餐饮食能促使小鼠出现进行性大泡和微泡脂肪变性、肝脏炎症、纤维化及动脉粥样硬化[21]。扶正化瘀胶囊可能通过干预肿瘤坏死因子、促炎症因子、脂质与动脉粥样硬化通路来减轻肝纤维化，达到护肝作用。

综上所述，本文运用GEO 数据库疾病差异基因分析联合网络药理学及分子对接验证的方法，初步探索扶正化瘀胶囊抗肝纤维的作用机制，主要涉及肿瘤坏死因子、炎症反应、氧化应激、代谢等方面，为后期进一步实验提供理论参考。