7省16个产地一枝黄花中芦丁、绿原酸、槲皮素含量测定与相关性分析

吴玲芬 李 敏 陈芝华

一枝黄花系菊科多年生草本植物一枝黄花Solidago decurrens Lour.的干燥全草，收录于2020 年版《中国药典》，具有清热解毒、疏散风热的功效[1-2]。一枝黄花在我国南方各省均有分布，包括江苏、浙江、江西、云南等省，别名蛇头王、见血飞、金锁钥、满山黄等[3]。一枝黄花富含黄酮、酚酸、萜类等多种活性成分，具有抗炎、抑菌、抗肿瘤等生理活性[4-6]。目前对于一枝黄花的研究鲜有含量测定，报道也仅限于单成分与少数产地[7-8]。黄酮类与酚酸类是一枝黄花的主要药效成分，包括芦丁、绿原酸、槲皮素等，其中芦丁是2020 年版《中国药典》规定的质量评价指标之一[1]。因此，我们收集了一枝黄花主产区的16 份新鲜药材资源，对其农艺性状、芦丁、绿原酸、槲皮素含量进行测定，并分析了其与经纬度、海拔间的相关性，以期为一枝黄花优良种质筛选及药材质量控制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 2021 年9 月至2021 年10 月，收集江苏、湖北、浙江、贵州、江西、云南、陕西等7 省16个产地一枝黄花新鲜健康植株，由丽水市人民医院陈芝华主管药师鉴定为菊科一枝黄花Solidago decurrens Lour.，见表1。

表1 供试一枝黄花种质资源

芦丁（B20771）、绿原酸（B20781）、槲皮素（B20527）标准品购于上海源叶生物科技有限公司，乙腈（色谱级）、甲醇（色谱级）购于杭州宝诚生物技术有限公司，甲醇、乙醇、冰醋酸等均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 农艺性状测定 挑取每个产地健康完整的新鲜植株，用卷尺测量株高，用游标卡尺测量茎粗，随机选择3 片叶片，用直尺测量叶长与叶宽，计算叶长宽比为叶长与叶宽的比值，n=15。

1.2.2 芦丁、绿原酸、槲皮素含量测定

1.2.2.1 色谱条件 安捷伦1260 色谱仪（Agilent Eclipse XDB-C18 色谱柱，4.6×250 mm，5 μm），流动相乙腈—0.2%醋酸水，流速1.0 mL/min，梯度洗脱，检测波长（326 nm、360 nm、371 nm），进样量10 μL，柱温30 ℃。高效液相色谱图见图1。

图1 一枝黄花HPLC 色谱图样品（a）与标准品（b）（1，芦丁；2，绿原酸；3，槲皮素）

1.2.2.2 线性关系考察 配制1 mL 含芦丁162.40 μg、绿原酸158.00 μg、槲皮素161.52 μg 的混合标准品溶液，分别精密量取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0、2.0 mL混合标品溶液，用甲醇定容至10 mL 容量瓶，取适量溶液过0.45 μm 滤膜，在“1.2.2.1 色谱条件”下测定峰面积，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，见表2。

表2 线性关系考察

1.2.2.3 样品含量测定 精密称取一枝黄花样品粉末0.2 g，加入70%乙醇50 mL 提取，室温下超声提取30 min（600 W，40 kHz），旋干后，用纯甲醇定容至25 mL 容量瓶，取适量溶液过0.45 μm 滤膜，在“1.2.2.1 色谱条件”下测定峰面积，n=3。

1.2.2.4 精密度考察 取混合标准品溶液，在“1.2.2.1 色谱条件”依次进样6 次（n=6），芦丁、绿原酸、槲皮素峰面积RSD 分别为0.73%、0.88%与1.33%，表明本试验仪器精密度良好。

1.2.2.5 稳定性考察 随机取一枝黄花SD14 样品，按照“1.2.2.3 样品含量测定”制备样品溶液，室温避光条件下，分别在0、2、4、8、12、24 h 进样测定芦丁、绿原酸、槲皮素含量（n=6），得RSD 分别为2.92%、2.38%与1.84%，表明一枝黄花样品溶液在室温避光条件下24 h 内稳定。

1.2.2.6 重复性考察 随机取一枝黄花SD8 样品，精密称取样品6 份，按照“1.2.2.3 样品含量测定”下测定芦丁、绿原酸、槲皮素含量（n=6），得SD8 平均含量分别为0.32%、0.36%与0.29%，RSD 分别为1.09%、2.76%与2.41%，表明试验重复性良好。

1.2.2.7 加样回收率试验 随机取一枝黄花SD12样品，精密称取样品6 份，加入适量芦丁、绿原酸与槲皮素标准品，按照“1.2.2.3 样品含量测定”下测定芦丁、绿原酸、槲皮素含量（n=6），计算加样回收率=（检测量－样品中量）/加入标品量×100%，各含量加样回收率见表3。

表3 加样回收率考察

表4 不同产地一枝黄花农艺性状、芦丁、绿原酸、槲皮素含量比较

1.2.2.8 数据分析 采用ANOVA 单因素分析，聚类分析按照欧式距离进行划分，采用组内连接法（Within-groups linkage）。

2 结果与分析

2.1 不同产地一枝黄花农艺性状、有效成分含量比较分析 16 个产地一枝黄花农艺性状、芦丁、绿原酸、槲皮素含量存在差异。农艺性状方面，云南产一枝黄花植株生长势较好，其中云南屏边样品在株高、茎粗、叶长、叶宽指标最高，分别达105.42、0.46、8.45与1.45 cm；湖北与陕西产一枝黄花植株较矮，其中湖北长阳株高、陕西宁强茎粗、湖北巴东叶长、陕西太白叶宽指标最低，分别为55.43、0.29、4.98 与0.85 cm；江苏句容植株叶片最为狭长，叶长宽比为6.96，而湖北巴东植株叶片最为宽钝，叶长宽比仅为4.45。有效成分含量方面，浙江产一枝黄花中芦丁、绿原酸、槲皮素成分含量较高，其中浙江缙云芦丁与槲皮素含量、浙江景宁绿原酸含量指标最高，分别为0.37%、0.31%与0.36%；而陕西宁强样品芦丁含量、云南富宁绿原酸含量、湖北长阳槲皮素含量指标最低，分别为0.12%、0.09%与0.07%，见表3。

2.2 相关性分析 16 个产地一枝黄花中芦丁、绿原酸、槲皮素含量与农艺性状、经纬度、海拔间存在相关性（见表5）。芦丁含量与茎粗、叶长、叶宽、经度呈正相关关系，其中与经度呈显著正相关，相关系数为0.563（P＜0.05），与海拔呈显著负相关，相关系数为0.649（P＜0.01），与株高、纬度相关性较低；绿原酸含量与叶宽、经度、纬度呈正相关关系，其中经度为显著正相关，相关系数为0.664（P＜0.01），与海拔呈显著负相关，相关系数为0.532（P＜0.05），与株高、茎粗、叶长相关性较低；槲皮素含量与株高、茎粗、叶长、叶宽、叶长宽比、经度均呈正相关，其中与经度为显著正相关，相关系数为0.557（P＜0.05），见表5。

表5 一枝黄花中芦丁、绿原酸、槲皮素成分含量与农艺性状、生境因子间的相关性系数

2.3 聚类分析 以农艺性状、芦丁、绿原酸、槲皮素含量为指标，可将16 个产地一枝黄花划分为4 个居群（见图2）。居群Ⅰ共5 个产地，为江苏宜兴、陕西宁强、陕西太白，该居群一枝黄花植株矮小，茎细，叶片较小，陕西宁强、陕西太白样品3 种成分含量较低，江苏宜兴样品芦丁与绿原酸含量中等，槲皮素含量较高；居群Ⅱ共6 个产地，为江苏溧阳、江西浮梁、贵州赤水、江西婺源、江苏句容与贵州凯里，该居群植株中等高度，茎中等粗度，叶片除江苏溧阳较宽钝外，其余偏狭长，本居群中江西、贵州产地3 种有效成分中等含量，而江苏产地有效成分含量较高；居群Ⅲ共3 个产地，均是浙江产地，为浙江临安、浙江缙云、浙江景宁，该居群植株较高，生长势较好，茎粗，叶片大而多偏狭长，3 种有效成分含量最高；居群Ⅳ共2 个产地，为云南屏边与云南富宁，云南产一枝黄花植株最高，茎粗，叶片大而偏狭长，但3 种有效成分较低。

图2 聚类分析图

3 讨论

一枝黄花是我国传统药材，临床应用广泛。本试验探讨了提取方法（索氏提取、加热回流、超声），提取时间（20、30、40 min），溶剂提取浓度（70%、95%、纯乙醇）及流动相（乙腈—水，乙腈—醋酸水，甲醇—醋酸水）对一枝黄花中芦丁、绿原酸、槲皮素含量测定的影响，发现这3 种成分在70%乙醇作为提取溶剂，室温条件超声提取（600 W，40 kHz）30 min，即可提取完全，在“1.2.2.1 色谱条件”下芦丁（360 nm）、绿原酸（326 nm）、槲皮素（371 nm）出峰时间分别为7.19、13.25、16.45 min，分离度与峰型较好，理论塔板数均不低于2500。本试验建立的HPLC 切换波长法可同时检测一枝黄花中芦丁、绿原酸与槲皮素的含量，方法操作简便，准确度高，重复性好，可用于该药材质量评价。

药用植物体内次生代谢产物的积累受遗传因素、土壤、光照、经纬度、海拔等诸多因素的影响[9]。本试验收集的16 个产地中，浙江产一枝黄花中芦丁、绿原酸、槲皮素含量最高，江苏、湖北、贵州产地其次，而江西、云南、陕西产地相对较低。从芦丁含量看，16 个产地一枝黄花均满足2020 年版《中国药典》规定的芦丁不低于0.10%的含量标准，表明一枝黄花总体药材质量较好。相关性分析显示，一枝黄花中芦丁、绿原酸、槲皮素含量均与经度呈显著正相关，与海拔呈负相关，结果提示在本试验经度与海拔范围内，高经度、低海拔种植一枝黄花，有利于其药材中芦丁、绿原酸、槲皮素含量积累。