基于代谢组学分析碱性成纤维细胞生长因子对糖尿病小鼠肝损伤的作用

于雯飘，舒琦，魏婷婷

1.温州医科大学 第一临床医学院（信息与工程学院），浙江 温州 325035；2.浙江省肿瘤医院 药剂科，浙江 杭州 310022；3.温州医科大学 实验动物中心，浙江 温州 325035

糖尿病是一种因胰岛素抵抗、胰岛素分泌不足或两者兼有而引起的以高血糖为主要特征的代谢性疾病。糖尿病患者长期高血糖会导致各种器官和组织的慢性损害和功能障碍，从而引发一系列累及全身的并发症，包括视网膜病变、肾病、心肌病、肝病和认知功能障碍等，其中糖尿病肝损伤的发生率越来越高，多发于2型糖尿病，以非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD）最常见[1]。由于胰岛素抵抗引起的糖脂代谢紊乱致使肝细胞中脂质积累过多，不仅会干扰代谢过程，还会导致肝细胞线粒体功能障碍，氧化磷酸化减少，氧化应激增加，以及超微结构异常，最终造成NAFLD、肝纤维化、肝硬化甚至肝癌[2]。目前，虽然对糖尿病肝病进行了一些研究，但其病理生理机制尚未阐明，仍然缺乏有效的治疗策略和治疗药物。成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor, FGF）是广泛分布于人体内的生长因子，对糖尿病的治疗具有巨大潜力。近年来，有研究发现FGF19、FGF21、FGF23等对心血管疾病以及非酒精性脂肪肝等疾病的治疗起重要作用[3]。但是碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor basic, bFGF）对糖尿病肝损伤的研究较少，其是否可以改善糖尿病肝损伤引起的代谢紊乱及其代谢机制尚不清楚。代谢组学在疾病的早期诊断和机制研究以及药物研发等领域均已有广泛应用。本研究通过基于核磁共振氢谱（1H nuclear magnetic resonance,1H NMR）的代谢组学方法探讨bFGF与糖尿病肝损伤之间的关系和可能的代谢机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物 9只雄性C57BL/6J野生型小鼠，体质量20～30 g，14只8周龄雄性自发性糖尿病db/db小鼠，体质量50～70 g，均购自南京大学模式动物研究所，饲养于温州医科大学实验动物中心。小鼠均进行适应性饲养1周后进入下一步实验，饲养期间自由饮食、饮水。实验动物许可证号：SYXK（浙）2020-0014。

1.2 主要试剂与仪器 D2O（99.9%氘代）购自英国剑桥同位素实验室，三甲硅烷基丙磺酸钠（TSP）购自美国Sigma公司，Bruker AVANCE III 600 MHz NMR波谱仪购自德国Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 实验分组和给药：将6只C57BL/6J小鼠设为对照组（wt组），5只db/db小鼠为糖尿病肝损伤组（db/db组），9只db/db小鼠为bFGF给药组（bFGF组）。用0.9%氯化钠溶液将bFGF稀释成0.2 mg/mL后保存于-80 ℃冰箱备用。所有小鼠饲养至10周龄后开始实验，bFGF组小鼠每隔1 d腹腔注射1次bFGF，注射时间均为早上8点，注射剂量为0.5 mg/kg，注射10周后处死小鼠。而wt组和db/db组在相同时间注射0.9%氯化钠溶液作为对照。

1.3.2 样本收集：小鼠饲养至20周时，通过脱臼处死小鼠后快速分离出肝脏组织装入冻存管，经液氮速冻后于-80 ℃超低温冰箱中保存。

1.3.3 肝脏组织HE染色：分离肝脏组织，4%多聚甲醛溶液固定6 h，用不同浓度的乙醇和二甲苯逐级脱水，石蜡包埋，作3～5 μm切片，HE染色，在200倍显微镜下观察肝脏组织形态学变化。

1.3.4 肝脏样本代谢物提取：采用甲醇-氯仿-水法提取肝脏组织中水溶性的小分子代谢物[4]。取冰冻组织称重后移至EP管中，分别加入4 mL/g甲醇、4 mL/g氯仿和2.85 mL/g蒸馏水，运用高通量粉碎机（60 Hz，2 min）匀浆使组织破碎呈现均匀的浆液后，涡旋15 s，然后把样品置于冰上15 min后，在 4 ℃、5 000×g条件下离心15 min，取上清液，通过液氮预冻后置于冷冻干燥机中冻干48 h至粉末状。NMR样品的制备：取冻干的样品加入含0.04 mmol/L TSP的D2O 500 μL，涡旋15 s至充分溶解后在4 ℃、12 000×g条件下离心10 min，最后将上清液转移至5 mm NMR样品管中待1H NMR图谱采集。

1.3.5 肝脏组织的1HNMR检测：使用Bruker AVANCE III 600 MHz超导高分辨核磁共振谱仪进行采集1H NMR图谱。具体参数如下：标准温度298 K，zgpr标准脉冲序列，预饱和方式压制水峰，谱宽为12 000 Hz，数据采集点数为64 K，弛豫延迟为6 s，累加次数为128次，扫描时间为2.65 s。

1.3.61HNMR谱图的数据处理和分析：采用Bruker Topspin软件对采集的1H NMR图谱进行相位和基线的调整，对TSP峰定标（δ=0 ppm）。由于葡萄糖峰非常明显，对后续分析结果的干扰很大，因此需要将其去除[5]。为消除饱和水峰带来的谱线扭曲，去除预饱和压水峰后残留的水峰区。对每段积分值都相对于该谱的所有积分值进行归一化处理后，将数据导入SIMCA-P+12.0软件包（瑞典Umetrics公司）进行多元统计分析。采用偏最小二乘判别分析（partial least-squares discriminant analys,PLS-DA）探讨多组代谢模式的差异。PLS-DA图上的每个点代表一个样本的代谢模式，PLS-DA图对应的loading图反映积分区间对PLS-DA图中分组的贡 献[6-7]。

1.4 统计学处理方法 采用SPSS13.0软件进行统计学分析。数据以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠肝组织病理形态改变 HE染色结果显示，wt组小鼠肝小叶和肝窦结构清晰，细胞大小形态一致；db/db组小鼠肝细胞脂肪变性明显，可见局灶性坏死及炎细胞浸润；bFGF干预后，脂滴和炎性细胞明显减少，细胞坏死损伤减轻。见图1。

图1 wt组、db/db组和bFGF组肝脏组织的HE染色（×200）

2.2 小鼠肝脏组织1H NMR谱结果 通过1H NMR谱可以同时获得许多小分子代谢物信息，其代谢物归属为：亮氨酸（δ 0.95）、异亮氨酸（δ 1.0）、缬氨酸（δ 1.04）、3-羟基丁酸（δ 1.2）、乳酸（δ 1.32，δ 4.1）、丙氨酸（δ 1.49）、乙酸（δ 1.91）、谷胱甘肽（δ 2.1，δ 2.55）、琥珀酸（δ 2.41）、谷氨酰胺（δ 2.45）、肌酐（δ 3.04）、胆碱（δ 3.21）、牛磺酸（δ 3.42）、甘氨酸（δ 3.55）、葡萄糖（δ 3.4～4.0）、麦芽糖（δ 5.42）、尿苷（δ 5.91）、三磷酸鸟苷（δ 5.95）、肌苷（δ 6.11，δ 8.28）、腺苷一磷酸（δ 6.14，δ 8.61）、延胡索酸（δ 6.52）、苯丙氨酸（δ 7.42）、烟酰胺（δ 7.59）、延胡索酸（δ 6.52）。见图2。

图2 小鼠肝脏组织的典型600 MHz 1H NMR谱图

2.3 PLS-DA结果 PLS-DA模式识别图中，wt组、db/db组和bFGF组小鼠肝脏的代谢模式能够明显区分开，说明3组小鼠肝脏的代谢模式有明显差别 （见图3A），对应的模式置换图也显示所建立的PLSDA模型是可行的（见图3B）。相应的彩色loading图结果表明，乳酸、谷胱甘肽、琥珀酸、胆碱、牛磺酸和苯丙氨酸对3组的区分有较大贡献（见图3C）。

图3 wt组、db/db组和bFGF组肝脏组织的PLS-DA模式识别图（A）、置换检验图（B）和彩色loading图（C）

为进一步筛选2组之间肝脏中重要的差异代谢物，本研究对wt组、db/db组和bFGF组两两之间进行了PLS-DA分析，其结果显示，3组两两之间的代谢模式均存在明显的差异。同时，通过PLS-DA图相对应的loading图分析差异代谢物，结果显示乳酸、谷氨酰胺、肌酐、谷胱甘肽、琥珀酸、丙氨酸、胆碱和牛磺酸是造成3组两两之间代谢差异贡献较大的特异性代谢物。见图4。

图4 wt组、db/db组和bFGF组肝脏组织的PLS-DA模式识别和对应的loading图

2.4 代谢物定量分析 与wt组相比，db/db组小鼠肝脏中亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、乳酸、琥珀酸、肌酐、甘氨酸、三磷酸鸟苷和苯丙氨酸的代谢水平显著降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）；但给予bFGF治疗后，bFGF组小鼠肝脏中亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、乳酸、琥珀酸、肌酐、甘氨酸、三磷酸鸟苷和苯丙氨酸的代谢物水平显著高于db/db组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。这些代谢产物主要涉及能量代谢、氨基酸代谢和核苷酸代谢。见图5。

图5 wt组、db/db组和bFGF组小鼠肝脏组织中差异代谢物的比较

3 讨论

据统计，到2035年全球糖尿病发生预计将达到5.92亿，糖尿病与肝脏病变有一定的关联，超过70%的糖尿病患者会出现肝损伤[8]，这与胰岛素抵抗和糖脂代谢异常密切相关[9]，糖尿病肝损伤的具体发病机制目前还不清楚。目前干预糖尿病肝损伤的措施主要是通过降低血糖的基础上，依靠干预生活方式来降低体质量，从而降低代谢性疾病的风险来实现，所以目前的治疗策略很有限。db/db小鼠是因瘦素受体基因突变引起的先天性肥胖的2型糖尿病模型，其糖尿病病程与人非常相似，是研究糖尿病肝损伤的理想模型[10]。近年来有研究[11]发现，bFGF够显著抑制db/db小鼠空腹和餐后血糖水平升高，改善胰岛素抵抗，但是bFGF治疗糖尿病肝损伤的具体机制尚不清楚。本研究从代谢角度出发探讨bFGF对糖尿病肝损伤的作用，为糖尿病肝损伤的治疗提供新视角。

肝脏是人体重要的代谢器官，肝病患者存在非常复杂的代谢紊乱，近年来科学家发现氨基酸代谢、能量代谢、甲胺代谢等与肝病的发病过程密 切相关[12]。支链氨基酸（branched-chain amino acids, BCAAs）是一类人体营养必需氨基酸，包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸。BCAAs是机体重要的能源物质，主要在心肌、神经元和肾脏等组织中分解代谢。BCAAs不仅参与合成蛋白质，还作为有效的细胞营养分子参与调控新陈代谢和细胞生长。近年来，众多研究[13-14]表明血浆BCAAs水平异常对神经、心血管、代谢疾病和癌症等疾病均有影响。其代谢与胰岛素分泌及胰岛素敏感性有关，并被认为是未来糖尿病风险的预测因子[15]。由于BCAAs在全身氮代谢中的特殊作用和血脑屏障运输中的竞争性作用，广泛应用于肝病患者。在一些研究中发现，补充BCAAs可有效下调肝硬化患者的蛋白质代谢，改善氮平衡，最终导致更好的临床结果[16]。本研究发现db/db小鼠BCAAs代谢明显低于wt组，值得注意的是，这种代谢异常在bFGF治疗后可以被恢复。结果表明bFGF对糖尿病肝损伤的作用机制可能与调节支链氨基酸代谢有关。与wt小鼠相比，db/db小鼠肝脏组织中甘氨酸的水平下降。肝是糖异生的主要器官，甘氨酸是重要的生糖氨基酸，它的水平下降可能表明在糖尿病发展成糖尿病肝损伤的过程中，糖异生途径增强，或者反映肝功能受损。由于肝功能受损导致氨基酸滤过增多，使组织中生糖氨基酸含量减少。说明糖异生与糖尿病肝损伤的发病机制是密切相关的。甘氨酸是一种非必需氨基酸，刘近春等[17]发现甘氨酸通过拮抗内毒素可以减轻脂肪肝的程度。据研究[18]报道，甘氨酸可抑制细胞凋亡和调节免疫力来抑制大鼠应激性肝损伤。本研究结果表明，bFGF给药能显著改善db/db小鼠肝脏组织中甘氨酸水平，这表明bFGF治疗糖尿病肝损伤可能通过改善甘氨酸代谢来实现。苯丙氨酸是很多生物学上重要物质的前体物质，如甲状腺激素类、儿茶酚胺类、黑色素、蛋白质，是人体的必需氨基酸。肝脏是苯丙氨酸代谢的主要场所，苯丙氨酸代谢水平可能反映肝脏的一个状态[19]。SELKOE[20]研究发现小麦蛋白水解液合剂（络氨酸、苯丙氨酸加碳水化合物）可作为营养补充剂快速升高健康人群的胰岛素水平。本研究发现，与wt组小鼠相比，db/db组小鼠肝脏组织中苯丙氨酸水平显著下降，而bFGF干预后可以在一定程度上恢复苯丙氨酸的异常代谢。所以，本研究结果表明bFGF可能通过改善氨基酸的代谢紊乱来保护糖尿病肝损伤。

葡萄糖代谢是维持机体生命活动能量的主要来源，是生命体主要的能量代谢，包括葡萄糖有氧氧化和糖酵解。有文献[21]报道指出，糖尿病动物模型体内糖异生加强，糖原分解加快，这使得内源性葡萄糖增加，并引发高血糖，相关的三羧酸循环和糖酵解途径也发生了紊乱。研究[22]报道肝衰竭患者肝功能严重损伤，导致三大物质代谢异常，血乳酸水平能较为准确的预测肝衰竭患者。与wt小鼠相比，db/db小鼠肝脏中三羧酸循环中间产物琥珀酸水平和糖酵解产物乳酸显著降低，这可能反映了高血糖产生的全身应激作用，与疾病的发病特点有关。而bFGF干预治疗后，琥珀酸和乳酸水平显著升高了。三羧酸循环和糖酵解途径中相关代谢物的变化表明bFGF对糖尿病肝损伤的作用与能量代谢密切相关。

三磷酸鸟苷是转录反应中鸟嘌呤核苷酸的提供者，为所有生命形式的基本单元，对代谢、心血管和神经等有重要作用。MEREDITH等[23]研究发现三磷酸鸟苷可以调节Ca2+诱导的胰岛素分泌。在临床上，三磷酸鸟苷可用于慢性肝炎、进行性肌萎缩等疾病的治疗[24]。db/db小鼠肝脏组织中三磷酸鸟苷水平的下降表明在糖尿病肝损伤发展过程中核苷酸代谢发生了紊乱。在本研究中，bFGF干预可以升高db/db小鼠肝脏中的三磷酸鸟苷。这提示bFGF对db/db小鼠糖尿病肝损伤的作用可能与核苷酸代谢有关。

肌酐是肾功能损伤的重要标志物[25]。肌酐主要来源是胃源性蛋白质摄入及肌肉代谢，在代谢过程中需要一些酶的参与，一些相关的酶由肝脏合成。当肝功能出现损害时，会导致肌酐生成、代谢受到影响，特别是肝脏功能出现衰竭时，容易出现肝肾综合征。王小华等[26]指出应用血清中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白联合血清肌酐能在早期准确诊断乙型肝炎肝硬化患者并发肝肾综合征。在本研究中，发现bFGF干预可以改善db/db小鼠肝脏中肌酐的异常降低。

综上所述，本研究运用基于1H NMR的代谢组学方法探究了bFGF与糖尿病肝损伤之间的关系，发现bFGF可以改善糖尿病肝损伤肝脏组织的代谢紊乱，主要涉及到能量代谢、氨基酸代谢和核苷酸代谢，为bFGF治疗糖尿病肝损伤提供新思路。