水中跑台训练通过促进水通道蛋白4的极性表达减轻大鼠脊髓损伤后的组织水肿

谢庆凤，谢媛媛，胡权，陈晓龙，林坚炜，应新旺

温州医科大学附属第二医院育英儿童医院 康复医学中心，浙江 温州 325027

脊髓水肿是继发性脊髓损伤（spinal cord injury, SCI）的关键病理过程之一，对脊髓功能的预后恢复有重要影响[1-2]。目前治疗脊髓水肿的方法有限，主要针对破坏性水肿发展后的对症治疗，疗效欠佳[3]。因此，根据脊髓水肿的发生和发展规律采取相应的康复措施来抑制脊髓水肿发展并消退水肿至关重要。星形胶质细胞的基底膜、周细胞和末端足突构成血脊髓屏障（blood-spinal cord barrier, BSCB）系统，保护和调节脊髓实质[4-6]。水通道蛋白4（aquaporin 4, AQP4）广泛分布在中枢神经系统，是调节水通透性和水代谢的主要分子途径[7-8]。当血管源性水肿时，血管周围的星形胶质细胞终足膜上密集表达的AQP4在流体静力压的驱动下，介导水从细胞外间隙转运进毛细血管，加速水分清除，减轻水肿。这种细胞特定部位的表达形式称之为AQP4的极性表达[3，9]。运动疗法是目前临床上SCI后有效的康复措施之一[10-11]。由于大鼠SCI后不能进行正常的运动训练，本课题组将运动和水疗相结合，设计水中跑台进行训练来模拟临床上的运动疗法。本研究旨在探讨水中跑台训练（water treadmill training, TT）对大鼠SCI后脊髓水肿的作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 动物：80只清洁级2～3月龄SD大鼠，体质量220～250 g，购自北京维通利华实验动物有限公司，实验动物许可证号：SCXK（京）2012-0001。本研究已通过温州医科大学实验动物福利伦理委员会审批（编号：wydw2020-0602），符合实验动物伦理学要求。

1.1.2 试剂：AQP4抗体和CD31抗体（美国Affinity 公司）；GFAP和Tubulin抗体（美国Abcam公司）；山羊抗兔/山羊抗小鼠二抗（上海翌圣生物科技有限公司），EB染料试剂盒（上海雅吉生物科技有限公司），HE染色试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分组及处理：将大鼠按随机数字法分为假手术不处理组（Sham-Con）、假手术运动组（Sham-TT）、脊髓损伤组（SCI-Con）和脊髓损伤运动组（SCI-TT），每组各20只。

1.2.2 大鼠SCI模型制作：术前对大鼠进行24 h的空腹禁食处理。首先进行2%戊巴比妥钠（0.6 mL/100 g） 腹腔注射麻醉，找到大鼠第十三肋骨体表标记及棘突做一个约3 cm的纵行切口，精确定位T9-T11，暴露出棘突和椎板，用咬骨钳摘除椎板。充分暴露脊髓实质长度约1 cm后，用纽约大学脊髓打击器精确撞击目标区域制作大鼠脊髓不完全损伤模型（T10打击，2.5 cm 10 g）。脊髓打击节段表面迅速出现局部水肿、淤血但硬脊膜完整以及大鼠双下肢及尾部出现抽动等表现即视为造模成功，接着再逐层缝合肌肉组织，术后注意大鼠体温的控制。术后早晚各行1次协助排尿排便，同时给予青霉素预防伤口感染。

1.2.3 大鼠行为学评分：Bssso Beattie Bresnahan （BBB）评分分别于造模后1、3、7、14 d，晚上 19：00—20：00进行。将大鼠后肢功能分为22个等级，最小值0分，最大值21分。为避免个人主观因素对评分结果的影响，BBB评分过程采用双盲、双人独立观察记录，结果取平均值[4]。

1.2.4 含水量检测：用2%戊巴比妥钠过度麻醉后，快速取出大鼠T10脊髓，称量湿重，然后在80 ℃的温度干燥箱中干燥24 h至恒定重量。该节段水肿程度按（湿重-干重）/湿重×100%进行计算。

1.2.5 EB染料分析：大鼠尾静脉注射EB染料 （4 mL/kg）。将含T10的脊髓组织放入温度为50 ℃的二甲基甲酰胺中72 h。根据标准曲线测定各组样品中EB染料的浓度（μg/g）。

1.2.6 TT：水温设置在30 ℃，水深至大鼠胸骨剑突处。运动组大鼠在SCI造模前3 d予适应性跑台（6～10 m/min，15 min）。术后第2天Sham-TT/SCITT组大鼠开始正式跑台训练（10～15 m/min，5 min为1组，共3组，组间间歇5 min，共训练14 d）。

1.2.7 Western blot检测AQP4和GFAP蛋白：用BCA法测蛋白，以60 μg蛋白量为标准，以15 μL为上样量配置上样样品。电泳起始时用80 V，待Mark进入分离胶后，再用120 V电泳至Mark跑至凝胶底部。用300 mA恒流电转膜约90 min。转膜后置入5%脱脂牛奶中封闭2 h。然后加入一抗4 ℃过夜。隔日TBST漂洗后加入二抗（1:2 000）室温孵育1 h。ECL显影后用ImageJ软件对条带吸光度值进行分析。

1.2.8 HE染色：切好的石蜡切片放置于65 ℃烘箱烤片1 h。将载玻片依次放入通风橱内的二甲苯溶液①②中，每个搪瓷杯中放置10～15 min。将脱好蜡的玻片，依次放入100%、100%、90%、90%、85%、75%乙醇中，每个5 min，梯度脱水。双蒸水浸泡 10 min，取出后放入苏木精水溶液中染色2 min。自来水冲洗30 s，酸水及氨水中分色，各数秒。玻片流水冲洗1 h后入双蒸水片刻，再入75%无水乙醇（5 min）、85%无水乙醇（5 min）、95%无水乙醇（5 min）。入伊红液染色2～3 min。透明：100%无水乙醇（5 min）、100%无水乙醇（5 min）、二甲苯 （5 min）、二甲苯（5 min）。将已透明的切片滴上中性树脂，盖上盖玻片封固。待树脂略干后，贴上标签，标记标本。在显微镜下观察并采集图片。

1.2.9 免疫荧光三标染色：石蜡切片脱蜡漂洗后，用10%山羊血清在室温下封闭2 h，滴加兔抗大鼠AQP4抗体（1:100）、山羊抗大鼠CD31抗体（1:100）/小鼠抗大鼠GFAP抗体混合液（1:100）于湿盒中孵育（4 ℃）16～20 h。复温漂洗后滴加二抗（混合液孵育2 h，避光），漂洗后经10% DAPI染核5 min（避光），最后滴加防荧光猝灭剂封片，在荧光显微镜下显影观察拍照。

1.2.10 免疫电镜：灌注取脊髓组织，经固定-梯度脱水-包埋后进行连续切片，选择厚为70～80 nm的超薄切片，置于超纯水悬浮5 min，清洗封闭后加一抗4 ℃过夜孵育，隔日加二抗后进行铀复染，最后烘干后在透射电子显微镜下观察并采集图像，黑色10 nm大小的金颗粒即为阳性表达。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS16.0统计软件进行分析。所有数据以±s表示，使用Kolmogorov-Smirnov检验作为正态检验，方差齐性检验采用Levene检验；组间差异分析采用单因素方差分析和Tukey’s检验；当方差不齐时采用Dunnett’s T3检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TT对大鼠SCI后组织形态和水肿的影响 与Sham-Con组比，Sham-TT组大鼠脊髓含水量差异无统计学意义（P＞0.05）；SCI-Con组大鼠脊髓的含水量较Sham-Con组显著增加（P＜0.05）。与SCI-Con组比，SCI-TT组大鼠组织含水量显著下降（P＜0.05），见图1A、图1C。通过HE染色观察T9-T11水平脊髓前角的组织形态学变化，结果显示Sham-Con组和Sham-TT组未见明显的病理改变；与Sham-Con组相比，SCICon组大鼠脊髓前角灰质严重受损，神经元排列紊乱，细胞肿胀、结构模糊、核固缩溶解；与SCI-Con组大鼠相比，SCI-TT组大鼠前角组织排列更规则、组织的病理学改变均有不同程度地减轻，见图1B。BBB评分结果显示Sham-Con组和Sham-TT组大鼠运动功能完全正常。在SCI术后1 d和3 d，SCI-Con组和SCI-TT组的BBB评分差异无统计学意义（P＞0.05）；术后7 d时，SCI-TT组大鼠BBB评分高于SCI-Con组（P＜0.05）；在SCI后14 d，与SCI-Con组相比，SCI-TT组大鼠BBB评分显著性增高，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1D。

图1 TT对大鼠SCI后组织形态和水肿的影响

2.2 TT对SCI大鼠BSCB的影响 EB染色结果显示Sham-TT组中EB染料与Sham-Con相比差异无统计学意义（P＞0.05）。在SCI后，与Sham-Con组比，SCICon组脊髓组织中的EB染料含量显著增加（P＜0.05）。与SCI-Con组相比，SCI-TT组的大鼠脊髓组织中EB染料含量显著减少（P＜0.05），见图2。

图2 EB染色和染色结果统计

2.3 TT对大鼠脊髓打击部位周围组织中AQP4和GFAP蛋白表达的影响 在各组中，AQP4蛋白的总表达量差异无统计学意义（P＞0.05）。与Sham-Con组相比，Sham-TT组中GFAP表达差异无统计学意义（P＞ 0.05）。SCI后，与Sham-Con组比，SCI-Con组组织中GFAP的表达量显著上升（P＜0.05）。与SCI-Con组相比，SCI-TT组中GFAP蛋白的总表达量显著下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图3。

图3 各组AQP4和GFAP蛋白表达情况

2.4 TT对AQP4与GFAP和CD31蛋白共表达的影响 在正常情况下，TT对于脊髓组织中AQP4与GFAP和CD31蛋白的共表达并无明显影响。与Sham-Con组相比，SCI-Con组中AQP4与GFAP和CD31的共标记表达增加。与SCI-Con组相比，SCI-TT组中AQP4与GFAP和CD31的共标记表达进一步增加，见图4。

图4 各组AQP4的极性表达情况

2.5 TT对AQP4蛋白极性表达的影响 在Sham组中，在星型胶质细胞足膜与内皮细胞的连接处可以观察到AQP4的免疫沉淀，但Sham-TT组与Sham-Con组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。与Sham-Con组相比，SCI-Con组中AQP4免疫沉淀显著增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。与SCI-Con组相比，SCI-TT组中AQP4的沉淀量进一步增加，差异有统计学意义（P＜0.05），见图5。

图5 各组AQP4蛋白极性表达情况

3 讨论

SCI分为原发性和继发性损伤过程[12-13]。原发性损伤是由外力引起的不可逆损伤；继发性损伤是在原发性损伤的基础上，由于脊髓水肿、出血、微管循环障碍等逐渐造成的神经功能受损[14-15]。脊髓水肿是继发性SCI的关键病理过程之一，对脊髓功能的预后恢复有重要影响[1-2]。AQP4广泛分布在中枢神经系统，是调节水通透性和水代谢的主要分子途径，研究发现在成年大鼠脊髓内有AQPs的四种亚型，其中AQP4表达量最高[7]。本研究观察到正常大鼠或者SCI大鼠进行TT后脊髓组织中的AQP4总蛋白表达变化差异无统计学意义。这提示SCI和跑台干预并不会影响AQP4的表达，然而结合本研究中对组织水肿含水量的检测结果，又提示SCI后脊髓水肿明显增加，在运动训练后水肿程度又减轻。这表明运动训练可能并不是通过直接影响AQP4的蛋白表达起到水肿减轻作用，而是通过影响AQP4的其他形式来发挥作用。

有研究发现SCI 2周后，当活化的星形胶质细胞移动到损伤区后，伴随着AQP4的表达增加，同时也发现慢性SCI阶段AQP4表达虽增加，但神经胶质外侧界膜的星形细胞终足膜上AQP4免疫标记量减少，即AQP4极性表达缺失[16-17]。以往的研究及前期实验发现，SCI 14 d后，AQP4主要表达于星形胶质细胞胞体上，而非极性表达到星形胶质细胞终足膜上，这延缓了水分的清除。在血管源性水肿阶段，增加AQP4从星形胶质细胞突起或胞体转运到血管周围终足膜发挥水分清除作用将是减轻水肿的关键机制[18-19]。本研究对于大鼠SCI后AQP4在星型胶质细胞上的极性表达进行了探索。实验结果显示，在正常情况下，AQP4主要表达在星型胶质细胞的胞体上。在正常训练组中也观察到类似的AQP4表达情 况，但是两组间差异无统计学意义。大鼠SCI后，我们发现在星形胶质细胞足膜上的AQP4表达增加，这可能是机体对于损伤引起的水肿的自我清除作用，但这种形式的清除速度较慢，难以促进细胞功能的恢复。

运动疗法是一种低成本、不良反应小的治疗方法，已被证明可以促进SCI后的恢复[20-21]。同时，水的浮力可以降低SCI大鼠向前运动的阻力，增加对大鼠有益的物理刺激。此外，TT的深度和速度可以调节，这便于控制运动强度[22-23]。因此，本课题组使用水中跑台对SCI大鼠进行干预，来模拟临床上对SCI患者的运动疗法。研究结果发现运动训练后，SCI大鼠的脊髓水肿明显减轻、组织结构也明显改善、在伤后7 d和14 d大鼠的运动功能恢复明显。同时，结合EB染色的结果，我们发现在训练后，SCI大鼠BSCB的稳定性增加，血管的渗透性得到改善。

本研究也对运动干预后AQP4的表达情况进行了分析。结果显示，SCI后星型胶质细胞终足端上的AQP4表达增加，对应着胞体上的AQP4表达减少，这提示SCI后星形胶质细胞内AQP4可能存在某种转移现象，后续将进行深入探索。同时结合Western blot结果中与SCI-Con组相比，SCI-TT组中AQP4总量表达不变的现象，我们推测这一结果可能是由于运动疗法促进了星型胶质细胞中AQP4从胞体向足端转移导致。同时，免疫电镜检查的结果也验证了这一猜想。但是我们目前无法确定AQP4在星形胶质细胞中到底是如何转移到足端、这种转移是否有其他机制参与。当然也鉴于体内的信号分子机制错综复杂，运动疗法减轻脊髓水肿的直接分子机制还需要进一步深入探索。

当下用于SCI的康复治疗手段虽然越来越多，但相关的机制未阐明。因此，研究康复治疗手段对SCI后脊髓水肿的作用机制，对于康复治疗的推广及精准康复具有重要意义。目前在SCI的相关研究中，有关AQP4极性表达在脊髓水肿方面的分子机制研究较少。本研究结果表明TT可以保护BSCB系统，减轻大鼠SCI后的脊髓水肿，促进大鼠的运动功能恢复，其保护作用可能与促进星形胶质细胞胞体上的AQP4向终足端转移有关。因此推测AQP4在终足膜上的极性表达可能是TT减轻SCI后组织水肿的关键机制，为SCI后水肿发生发展的治疗提供新的靶点和策略。当然，本研究也存在一些局限性。首先在这项研究中，团队只使用了雄性大鼠，忽略了性别可能造成的任何结果差异。其次，未观察TT对大鼠体质量的影响。整体上实验设计训练周期短，不能完全反映临床上长期进行运动康复的机体分子机制变化。在后续研究中，我们会对上述问题进行改善，进一步揭示运动训练通过调控AQP4的极性表达减轻水肿的确切机制。