LncRNA GAS5 对结直肠癌5-FU 耐药的作用研究

聂启鸿 钟晓鸣

LncRNA-GAS5 被确定为多种癌症的抑癌基因,且被证实参与了结肠癌的发生发展。但是LncRNA GAS5在结直肠癌中的作用尚不明确。有研究显示,LncRNA GAS5 通过干预磷酸酶及张力蛋白同源的基因(PTEN)通路参与调控非小细胞肺癌细胞对顺铂(DDP)的化学敏感性［1］。以5-FU 为基础的化学治疗方案可有效治疗结直肠癌,对改善无手术机会的患者的生存质量、延长生存期尤为重要。但5-FU 耐药大大限制其疗效［2］。5-FU 耐药机制的产生及应对策略是目前临床工作中亟需解决的问题。因此,本研究将探讨LncRNA GAS5 在5-FU 耐药结直肠癌细胞中的表达变化及其对5-FU 耐药结直肠癌细胞生物学行为的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系 人结肠癌细胞系HCT-8 和SW480 均购自American Type Culture Collection。

1.1.2 主要仪器与试剂 二氧化碳恒温孵育箱(Thermo Fisher Scientific),伯乐化学发光凝胶成像仪(美国伯乐),RT-PCR 仪(ABI),Applied Biosystems 9700 PCR仪(Life Technologies),凝胶图像分析仪(Alpha innotech),流式细胞仪(BD FACalibor)。通用型RNA提取试剂盒(广州美基生物),Opti-MEM 培养基(Gibco BRL),CCK-8 试剂盒、Lipofectamine 2000(Invitrogen),细胞RNA 提取试剂盒(北京天根生物),兔抗caspase-3 多克隆抗体、兔抗聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)多克隆抗体、兔抗B 淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)多克隆抗体、兔抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)多克隆抗体、兔抗Bcl-2 相关X 蛋白(Bax)多克隆抗体、过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)(Affinity),LV5-GAS5 Vector(上海吉玛)。

1.2 细胞培养、传代 将HCT-8 细胞系或SW480 细胞系用含10% FBS、100 IU/ml 青霉素、100 µg/ml 链霉素的McCoy's 5A 培养基重悬细胞,接种于细胞培养瓶,37℃、5%二氧化碳孵育箱,当细胞生长至80%融合度时传代。弃去培养基、清洗、消化、终止消化、离心,接种于培养皿中传代,每2 天换1 次培养基,取处于对数生长期的细胞用于后续实验。

1.3 5 -FU 耐药细胞株建立 向细胞培养基中加入5-FU 溶液,与细胞共培养。观察细胞状态并逐步升高5-FU 浓度,筛选出对5-FU 耐药的细胞继续培养。

1.4 RT-PCR 检测LncRNA GAS5 在结直肠癌 5-FU耐药细胞系中表达 分别经细胞总RNA 提取、RNA质量鉴定、逆转录反应、RT-PCR 反应、PCR 产物的相对定量分析。

1.5 构建LncRNA GAS5 过表达结直肠癌细胞模型设计合成LncRNA GAS5 过表达序列,将合成的序列构建至慢病毒载体,包装浓缩为 LncRNA GAS5 过表达慢病毒,将LV5-GAS5 慢病毒原液加入完全培养基；去除原细胞培养液,加入病毒培养液,孵育箱中培养,细胞状态恢复良好后,去除培养基,加入病毒培养液,继续孵育。同时用空载体Vector 建立对照组。

1.6 CCK-8 检测细胞增殖 对HCT-8 和SW480 细胞分别用LV5-GAS5 慢病毒侵染(GAS5 组)与空载体慢病毒侵染(Vector 组),转染后24、48、72 h 后加入CCK-8 溶液,孵育4 h。酶标仪测定450 nm 处细胞吸光度。

1.7 流式细胞术检测细胞凋亡 对HCT-8 和SW480细胞分别用LV5-GAS5 慢病毒侵染(GAS5 组)与空载体慢病毒侵染(Vector 组),48 h 后行Annexin V/PI 双染,流式细胞术检测细胞凋亡。

1.8 统计学方法 采用SPSS20.0 统计学软件处理数据。计量资料以均数±标准差()表示,组间比较用t检验；不同转染浓度、不同时间点的细胞相对增殖率,采用双因素方差分析(two-way ANOVA)；P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LncRNA GAS5 在结直肠癌5-FU 耐药细胞系中的表达 RT-PCR 检测显示,LncRNA GAS5 在结直肠癌 HCT-8 细 胞(见 图1A) 与SW480 细 胞(见 图1B)中的表达水平低于正常结肠细胞,差异有统计学意义(P<0.05)。

图1 LncRNA GAS5 在结直肠癌5-FU 耐药细胞系中表达情况

2.2 应用慢病毒载体构建LncRNA GAS5 过表达结直肠癌细胞模型 RT-PCR 检测显示,LV5-GAS5 组HCT-8 细 胞(见 图2A)、SW480 细 胞(见 图2B) 中LncRNA GAS5 表达显著高于Vector 组,差异有统计学意义(P<0.05)。

图2 LncRNA GAS5 在结直肠癌 5-FU 耐药细胞系中表达情况

2.3 过表达 LncRNA GAS5 抑制结直肠癌细胞增殖CCK-8 实验检测显示,LncRNA GAS5 能明显抑制HCT-8 细胞和 SW480 细胞的增殖(P<0.05)。见图3。

图3 上调LncRNA GAS5 表达可降低结直肠癌耐药细胞活性

2.4 流式细胞术检测过表达LncRNA GAS5 促进结直肠癌细胞凋亡 AnnexinV/PI 双重染色及流式细胞术结果显示,在结直肠癌 HCT-8 细胞(见图4A)与SW480细胞(见图4B)中LV5-GAS5 组的细胞凋亡比例也明显高于Vector 组,差异有统计学意义(P<0.05)。

图4 上调LncRNA GAS5 表达促进结直肠癌耐药细胞凋亡

3 讨论

LncRNA GAS5 是LncRNA 家族成员之一,其在多种癌细胞中表达异常,如胃癌、非小细胞肺癌、宫颈癌、乳腺癌等,被确定为多种癌症的抑癌基因［3-6］。有研究分析结肠癌中RNA 差异表达的数据发现,结肠腺癌中存在205 个LncRNAs 差异表达,LncRNA GAS5 也参与其中［7］。然而,LncRNA GAS5 在结直肠癌中的作用尚不明确。

结直肠癌是严重威胁人们生命的恶性肿瘤之一。随着生活习惯和饮食结构的改变,我国结直肠癌发病率逐年升高［8,9］。多数结直肠癌在发现时已出现局部进展或转移,丧失手术机会［10］。化学治疗对其改善生存质量、延长生存期尤为重要［10］。5-FU 可抑制胸苷酸合成酶活性干扰 DNA 制,诱导DNA 损伤,导致细胞周期阻滞和细胞凋亡［11］。以5-FU 为基础的化疗方案可有效治疗结直肠癌,但目前临床上5-FU 化疗获得性耐药现象普遍发生,严重影响疗效和预后［2］。深入研究5-FU 耐药产生的机制及寻找有效的应对策略是临床工作中亟需解决的问题。

研究发现,LncRNA GAS5 参与调节肿瘤细胞药物抗性。LncRNA GAS5 可通过介导 ABCB1 调节乳腺癌阿霉素耐药细胞对阿霉素的敏感性［12］。LncRNA GAS5 通过靶向抑制 miR-223-5p,抑制PI3K/Akt 信号通路,逆转MCF-7 细胞对他莫昔芬的耐药性［13］。但LncRNA GAS5 是否参与调控结直肠癌对5-FU 的耐药尚不清楚。

为探讨LncRNA GAS5 与结直肠癌5-FU 耐药的关系,我们检测了结直肠癌5-FU 耐药细胞系HCT-8 细胞和SW480 细胞中LncRNA GAS5 的表达变化。结果发现 LncRNA GAS5 在结直肠癌5-FU 耐药细胞中显著低表达。为了进一步探寻LncRNA GAS5 与5-FU 耐药特性之间的关系,我们过表达HCT-8 细胞和SW480 细胞中LncRNA GAS5,检测细胞对5-FU 的敏感性及生物学行为变化。结果发现,过表达LncRNA GAS5 后,HCT-8 细胞和SW480 细胞的增殖受到抑制,且细胞凋亡明显增加。这些研究结果表明LncRNA GAS5 在结直肠癌5-FU 耐药中发挥着重要作用。

综上所述,LncRNA GAS5 在结直肠癌的发生中发挥着关键的作用,能抑制结肠癌细胞系的增殖并促进其细胞凋亡。可为临床上寻找以LncRNA GAS5 为靶点的结直肠癌治疗方法提供理论依据。