加味葛根芩连汤对糖尿病db/db小鼠内质网应激及胰岛素抵抗的影响

王佳慧 ，柳荣 ，郝民琦 ，朱向东 ，梁永林

1.甘肃中医药大学基础医学院，甘肃 兰州 730000；2.宁夏医科大学中医学院，宁夏 银川 750004

糖尿病是一种严重的慢性代谢性疾病，患病人数呈逐年上升趋势，其中80%患者为2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）[1]。胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）是T2DM发生的重要环节，与T2DM发展密切相关[2]。肝脏为胰岛素作用的重要靶器官，改善肝脏IR被认为是缓解T2DM的重要途径[3]。研究显示，IR可通过多种途径破坏内质网环境稳态，诱导内质网应激（ERS），ERS的发生又进一步加重IR[4]。当ERS持续发生时，肌醇需求酶1（IRE1）作为ERS 的主要标志物被激活，并启动下游c-Jun氨基末端激酶（JNK）信号通路[5]。活化的JNK1/2可促进下游胰岛素受体底物1（IRS1）磷酸化，IRS1作为重要的胰岛素信号传导蛋白，与脂质代谢及IR有关[6-7]，下调JNK信号通路表达可抑制肥胖诱导的IR[8]。葛根芩连汤出自《伤寒论》，用于治疗湿热引起的腹泻、痢疾等。研究发现，葛根芩连汤能改善T2DM，可能与降低氧化应激水平、调节细胞因子表达有关[9-10]。本实验从内质网应激通路IRE1/JNK/IRS1 探究加味葛根芩连汤缓解T2DM小鼠IR的作用机制，为其治疗T2DM提供实验依据。

1 实验材料

1.1 动物

7周龄SPF级雄性db/db小鼠65只、雄性m/m小鼠13只，常州卡文斯实验动物有限公司提供，动物生产许可证号SCXK（苏）2016-0010。饲养于甘肃中医药大学实验动物中心SPF级屏障实验室，温度21～25 ℃，相对湿度50%～60%，12 h/12 h明暗交替，自由摄食饮水。本实验经甘肃中医药大学动物实验伦理委员会审批（2020-274）。

1.2 药物及制备

加味葛根芩连汤（葛根、黄芩、黄连、炙甘草、干姜），饮片购于甘肃中医药大学附属医院。上述饮片按8∶3∶3∶2∶0.5比例配伍，加入8倍量蒸馏水浸泡30 min，葛根先煎30 min，再与其余药物共煎30 min，过滤，残渣加8倍量蒸馏水继续煎煮30 min，合并2次滤液，浓缩成含原药材2 g/mL药液，分装，置于4 ℃冰箱保存备用。盐酸二甲双胍片，上海贤鼎生物科技有限公司，0.25 g/片，批号YKCFZOB，使用时用蒸馏水配制成0.01 g/mL溶液。

1.3 主要试剂与仪器

Trizol，日本Takara 公司，批号AJF1817A；5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液、10×电转液、牛血清白蛋白、吐温-20、改良油红O染色液、HE染色试剂盒，北京索莱宝科技有限公司，批号分别为T1070-500、D1060、424T053、1121S014、G1261、G1120；p-JNK 抗体、JNK 抗体，美国Immunoway 公司，批号分别为YP0157、YT2440；IRS1抗体、p-IRS1抗体、β-actin抗体、山羊抗兔IgG（H+L）二抗，英国Affinity公司，批号分别为Ab-AF6273、Ab-AF7150、Ab-AF7018、HRP-S001；反转录试剂盒、荧光定量试剂盒、TRIeasy，上海翌圣生物科技有限公司，货号分别为11141-C、11202ES08、10606ES60；空腹胰岛素（FINS）、游离脂肪酸（FFA）ELISA试剂盒，上海酶联生物科技有限公司，货号分别为202111、202111。JXFSTPRP-24L全自动样品快速研磨仪，上海净信公司；RS232C型微量核酸测定仪，德国Eppendorf公司；ABI-9700PCR扩增仪，美国Applied BioSystems公司；Advantage型血糖仪，德国罗氏公司；A1Cnow+糖化血红蛋白仪，三诺生物传感股份有限公司；ME203E/02型电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；D3024R型大龙台式高速冷冻离心机，广州深华公司；Epoch 型酶标仪，美国Bio Tek 公司；Chemray 240、Chemray 800型全自动生化分析仪，深圳雷杜生命科技公司。

2 实验方法

2.1 分组及给药

小鼠适应性喂养1周后检测空腹血糖（FBG），将FBG≥11.1 mmol/L db/db小鼠随机分为模型组、二甲双胍组和加味葛根芩连汤低、中、高剂量组，每组13只。13只m/m小鼠作为空白组。各组均采用普通饲料喂养，加味葛根芩连汤低、中、高剂量组按70 kg成人每日临床用量的3、9、15倍[9]并参照人与动物体表面积计算小鼠等效剂量，分别予6.4、19.1、31.9 g/kg加味葛根芩连汤灌胃，二甲双胍组予0.2 g/kg二甲双胍溶液灌胃，空白组和模型组予等量蒸馏水灌胃，每日1 次，连续12周。

2.2 取材

给药结束后，小鼠禁食不禁水过夜，摘眼球取血，常温静置后4 ℃、3 500 r/min离心10 min，分离血清，EP管分装后置于-80 ℃冰箱冻存。迅速分离完整肝脏，预冷生理盐水清洗，滤纸吸干水分，取部分肝组织于4%多聚甲醛溶液中固定，用于病理形态观察，剩余肝组织放入冻存管内，于液氮中冷冻，转移至-80 ℃冰箱保存。

2.3 体质量检测

给药结束后，小鼠禁食不禁水12 h，称量体质量。

2.4 血糖及血脂相关指标检测

给药结束后，小鼠禁食不禁水12 h，尾静脉采血，使用血糖仪检测FPG，使用糖化血红蛋白仪检测糖化血红蛋白（HbA1c）。ELISA 检测血清FINS、FFA 含量。全自动生化分析仪检测血清总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）含量。

2.5 HE染色

肝组织于4%多聚甲醛溶液中固定后，梯度乙醇脱水，石蜡包埋、切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，苏木素染细胞核，伊红染细胞质，梯度乙醇脱水，二甲苯透明后，中性树胶封片，显微镜下观察肝组织病理变化。

2.6 油红O染色

从液氮中取出肝组织，蒸馏水充分洗涤，油红O稀释液避光染色10～15 min，60%乙醇镜下分化至间质清晰，水洗。苏木素复染，水洗，甘油明胶封片，显微镜下观察肝组织脂质蓄积情况。

2.7 Western blot检测

取肝组织剪碎，置于EP管中，预冷PBS漂洗2次，加入RIPA裂解液（含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂），高通量冷冻组织研磨器研磨后，冰上裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，取上清液，BCA蛋白定量试剂盒进行定量分析后上样，蛋白经电泳分离，转膜，加牛血清白蛋白于室温轻摇封闭，TBST洗膜3次，加入IRE1、p-IRE1、JNK、p-JNK、IRS1、p-IRS1 一抗（均为1∶1 000）和β-actin一抗（1∶5 000），室温轻摇1 h后放入4 ℃冰箱过夜。次日复温30 min，TBST洗膜8 min×4 次，加入二抗（1∶5 000），37 ℃轻摇2 h，TBST洗膜，ECL显色后曝光。采用Image J 1.8.0软件进行分析，以β-actin为内参，计算目的蛋白相对表达量。

2.8 RT-qPCR检测

采用Trizol法提取肝组织总RNA，微量分光光度计测定OD值，计算RNA纯度及浓度。将总RNA反转录为互补cDNA，反应条件：42 ℃、2 min，24 ℃、5 min，55 ℃、15 min，85 ℃、5 min，1个循环。扩增程序为两步法，反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火/延伸30 s。以GAPDH 为内参，2-ΔΔCt法计算mRNA相对表达量。引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列见表1。

表1 各基因PCR引物序列

3 统计学方法

采用GraphPad Prism 8.0软件进行统计分析。计量资料以±s表示，符合正态分布组间比较用方差分析，方差不齐用秩和检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 加味葛根芩连汤对模型小鼠体质量的影响

与空白组比较，模型组模型小鼠体质量显著增加（P＜0.01）；与模型组比较，二甲双胍组和加味葛根芩连汤中、高剂量组小鼠体质量显著减少（P＜0.01）。见表2。

表2 各组小鼠体质量比较（±s，g）

表2 各组小鼠体质量比较（±s，g）

注：与空白组比较，##P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01；与二甲双胍组比较，△△P＜0.01

体质量24.09±0.87 52.08±2.83##45.35±1.59**49.32±1.81△△47.41±2.40**46.02±1.55**组别空白组模型组二甲双胍组加味葛根芩连汤低剂量组加味葛根芩连汤中剂量组加味葛根芩连汤高剂量组只数13 13 13 13 13 13剂量/（g/kg）0.2 6.4 19.1 31.9

4.2 加味葛根芩连汤对模型小鼠血糖及血脂相关指标水平的影响

与空白组比较，模型组小鼠FPG、HbA1c、FINS、FFA、TC、TG水平显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，二甲双胍组和加味葛根芩连汤高剂量组小鼠FPG、HbA1c、FINS、FFA、TC、TG 水平显著降低（P＜0.01，P＜0.05）。见表3。

表3 各组小鼠FPG、HbA1c、FINS、FFA、TC、TG水平比较（±s）

表3 各组小鼠FPG、HbA1c、FINS、FFA、TC、TG水平比较（±s）

注：与空白组比较，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与二甲双胍组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

组别空白组模型组二甲双胍组加味葛根芩连汤低剂量组加味葛根芩连汤中剂量组加味葛根芩连汤高剂量组TG/（mmol/L）1.42±0.48 4.89±0.58##1.65±0.51**4.16±0.46△△2.24±0.98**1.92±0.56**只数13 13 13 13 13 13剂量/（g/kg）0.2 6.4 19.1 31.9 FPG/（mmol/L）6.78±1.03 32.34±0.61##27.61±1.93**31.13±1.01△△30.01±1.33*△28.14±2.07**HbA1c/%4.34±0.20 12.04±0.80##6.92±0.62**11.01±1.81△△10.23±0.79**△△8.62±1.21**△FINS/（pmol/L）177.01±11.40 244.72±24.16##292.99±19.67**255.83±17.86△△266.94±23.32△270.07±31.83*△FFA/（μmol/L）540.00± 125.5 923.33±176.60##590.00±138.30**862.92±178.50△754.58±171.10 629.58±169.40*TC/（mmol/L）1.99±0.19 4.09±0.53##2.81±0.25**3.93±0.95△△3.50±0.23 2.98±0.30**

4.3 加味葛根芩连汤对模型小鼠肝组织病理变化的影响

HE染色结果显示，空白组小鼠肝组织染色均匀，组织形态结构完整，细胞排列整齐；模型组小鼠肝损伤严重，细胞排列紊乱，组织结构破坏；与模型组比较，其余给药组小鼠肝组织损伤均有减轻，以二甲双胍组效果最显著，加味葛根芩连汤高剂量组效果与二甲双胍组接近。见图1。

图1 各组小鼠肝组织形态（HE染色）

4.4 加味葛根芩连汤对模型小鼠肝组织脂质蓄积的影响

油红O染色结果显示，空白组小鼠肝组织染色清晰，细胞核呈蓝色，细胞内未出现红色脂滴；模型组小鼠肝组织有大量脂滴；与模型组比较，各给药组小鼠肝组织脂质蓄积情况均有改善，随着加味葛根芩连汤给药剂量增加，脂质蓄积显著减少，以二甲双胍组和加味葛根芩连汤高剂量组效果最显著，与空白组接近。见图2。

图2 各组小鼠肝组织脂质蓄积（油红O染色，标尺=25 μm）

4.5 加味葛根芩连汤对模型小鼠肝组织蛋白表达的影响

与空白组比较，模型组小鼠肝组织IRE1、p-IRE1、JNK、p-JNK蛋白表达显著升高，IRS1、p-IRS1蛋白表达显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组小鼠肝组织IRE1、p-IRE1、JNK、p-JNK蛋白表达显著降低，IRS1、p-IRS1蛋白表达显著升高（P＜0.05，P＜0.01）；与二甲双胍组比较，加味葛根芩连汤低、中剂量组小鼠肝组织IRE1、p-IRE1、JNK、p-JNK蛋白表达显著升高，IRS1、p-IRS1 蛋白表达显著降低（P＜0.01）。见图3、表4。

图3 各组小鼠肝组织IRE1、p-IRE1、JNK、p-JNK、IRS1、p-IRS1蛋白免疫印迹

表4 各组小鼠肝组织IRE1、p-IRE1、JNK、p-JNK、IRS1、p-IRS1蛋白表达比较（±s）

表4 各组小鼠肝组织IRE1、p-IRE1、JNK、p-JNK、IRS1、p-IRS1蛋白表达比较（±s）

注：与空白组比较，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与二甲双胍组比较，△△P＜0.01

组别空白组模型组二甲双胍组加味葛根芩连汤低剂量组加味葛根芩连汤中剂量组加味葛根芩连汤高剂量组p-IRS1 1.29±0.11 0.47±0.07##1.11±0.09**0.71±0.08**△△0.81±0.05**△△1.04±0.08**只数剂量/（g/kg）888888 0.2 6.4 19.1 31.9 IRE1 0.25±0.02 0.88±0.06##0.33±0.05**0.64±0.06**△△0.55±0.07**△△0.46±0.05**△△p-IRE1 0.36±0.03 1.15±0.08##0.41±0.04**0.67±0.05**△△0.49±0.05**0.37±0.04**JNK 0.23±0.02 0.86±0.04##0.37±0.05**0.69±0.06**△△0.62±0.08**△△0.46±0.03**p-JNK 0.77±0.13 1.72±0.12##0.87±0.06**1.44±0.12**△△1.13±0.10**△△0.95±0.12**IRS1 2.63±0.24 1.34±0.07##2.21±0.24**1.62±0.09*△△1.70±0.10**△△2.16±0.12**

4.6 加味葛根芩连汤对模型小鼠肝组织mRNA表达的影响

与空白组比较，模型组小鼠肝组织IRE1、JNK mRNA表达显著升高，IRS1 mRNA表达显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组小鼠肝组织IRE1、JNK mRNA表达显著降低（P＜0.01），二甲双胍组和加味葛根芩连汤高剂量组小鼠肝组织IRS1 mRNA表达显著升高（P＜0.05）。见表5。

表5 各组小鼠肝组织IRE1、JNK、IRS1 mRNA表达比较（±s）

表5 各组小鼠肝组织IRE1、JNK、IRS1 mRNA表达比较（±s）

注：与空白组比较，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与二甲双胍组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

IRS1 1.02±0.20 0.12±0.04##0.66±0.13**0.24±0.05△△0.35±0.03△0.44±0.09*组别空白组模型组二甲双胍组加味葛根芩连汤低剂量组加味葛根芩连汤中剂量组加味葛根芩连汤高剂量组只数剂量/（g/kg）888888 0.2 6.4 19.1 31.9 IRE1 1.00±0.03 24.31±0.76##1.87±0.06**14.84±5.07**△△5.29±1.01**3.58±0.22**JNK 1.11±0.52 7.20±0.49##1.47±0.15**4.58±1.20**△△2.67±0.21**1.49±0.28**

5 讨论

葛根芩连汤中葛根辛甘性凉，入脾胃经，既升阳止泻、生津止渴，又解表退热，为君药；黄连、黄芩清热燥湿、厚肠止痢、泻火解毒，为臣药；甘草甘缓和中，调和诸药，为佐使药。临床为避免苦寒伤胃，常佐以辛温之干姜制其苦寒之性[11]。现代对葛根芩连汤的应用并不局限于胃肠疾病，已被广泛用于糖尿病[9]、急性肺损伤[12]、高尿酸血症[13]等多种疾病研究及临床。

T2DM与代谢过程失调相关，显著特点为血糖异常升高。IR是胰岛素靶向组织对胰岛素产生抑制或延迟反应的状态，被认为是代谢综合征、非酒精性脂肪性肝病、动脉粥样硬化和T2DM等多种疾病的致病因素[14]。IR主要由细胞信号传导异常或包括脂肪、肝脏和骨骼肌在内的外周组织对葡萄糖摄取受损导致[15]。肝脏作为调控身体能量代谢的关键器官，参与调节糖异生、脂肪生成、线粒体生物生成等多种过程[3]。因此，调节肝脏IR是改善T2DM进展的关键途径。

ERS是发生IR主要原因[15]，内质网是一个巨大的膜状网络，负责蛋白质合成、成熟和运输。在真核细胞中，监控内质网腔内信号传导主要通过3种内质网膜相关蛋白实现，其中包括IRE1。生理状态下，IRE1与葡萄糖调节蛋白78（GRP78）结合，处于无活性状态[16-17]。ERS可激活IRE1，进一步激活下游JNK[18]，JNK表达降低有助于改善肥胖诱导的IR。当胰岛素与其受体结合时，p-IRS1会激活下游信号通路，影响糖原合成，JNK可通过调节IRS1磷酸化改善IR[19]。以上说明IRE1/JNK/IRS1信号通路在整个代谢网络中起重要作用。瘦素受体缺陷型db/db小鼠是公认的肥胖型糖尿病小鼠模型[20]，本研究从ERS调控通路出发，进一步探究加味葛根芩连汤缓解糖尿病模型小鼠IR的作用机制。

与空白组比较，模型组小鼠体质量、FBG、FINS及HbA1c均显著增加；各给药组小鼠体质量、FBG、FINS及HbA1c均有改善，以加味葛根芩连汤中、高剂量组和二甲双胍组最明显。模型组小鼠血清FFA、TC及TG水平显著升高，各给药组小鼠血清FFA、TC及TG水平显著降低，以二甲双胍组及加味葛根芩连汤中、高剂量组作用最明显。HE染色结果显示，模型组小鼠肝组织结构破坏严重，且组织内有大量脂滴，各给药组肝组织损伤均有减轻，肝细胞脂质蓄积情况有所改善，尤以二甲双胍组和加味葛根芩连汤高剂量组改善明显。Western blot和RT-PCR结果表明，模型组小鼠肝组织IRE1、JNK蛋白和mRNA表达升高，IRS1蛋白和mRNA表达降低，p-IRE1、p-JNK蛋白表达升高，p-IRS1蛋白表达降低；各给药组小鼠肝组织IRE1、JNK蛋白和mRNA表达降低，IRS1蛋白和mRNA 表达升高，p-IRE1、p-JNK 蛋白表达降低，p-IRS1蛋白表达升高，以加味葛根芩连汤中、高剂量组和二甲双胍组最明显。以上结果表明，加味葛根芩连汤可通过调控IRE1/JNK/IRS1信号通路减轻小鼠体质量，改善糖脂代谢，从而抑制IR，缓解内质网负荷，对T2DM治疗起积极作用。