推拿㨰法对兔骨骼肌急性钝挫伤组织TNF-α及SphK1、S1PR3表达的影响

王兰兰，薛惠天，孙梦龙，阮磊，黄博，彭亮

湖南中医药大学，湖南 长沙 410208

骨骼肌损伤是运动医学中的常见损伤，90%以上骨骼肌损伤由挫伤或肌肉过度拉伤造成[1]。骨骼肌损伤的快速恢复需要一系列细胞和调控因子参与，其中肌纤维的持续变性、炎症和纤维化都是影响肌肉再生的重要因素[2-3]。病理性纤维化是细胞外基质过度沉积引起正常组织被胶原瘢痕取代所致，导致组织功能障碍[3]。推拿对骨骼肌损伤纤维化相关疾病疗效显著[4-5]。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）是介导炎症反应的促炎因子，肌肉损伤后炎症因子侵入损伤部位，炎症反应的性质、持续时间和程度可对肌肉修复或纤维化产生重大影响[3，6-8]。鞘氨醇激酶-1（SphK1）属于SphKs中的一员，主要位于细胞质，在鞘脂代谢过程中发挥细胞内信号转导酶和关键限速酶的作用。SphK1能够将鞘氨醇转化为1-磷酸鞘氨醇（S1P）[9]。S1P是一种多生物活性鞘脂，是真核细胞信号转导的重要介质。S1P与细胞膜上S1P受体（S1PR）结合后发挥作用，以调节对生物过程至关重要的信号通路，包括细胞生长、免疫细胞运输和炎症[10]。S1PR 是G-蛋白偶联受体（GPCR）家族成员，包括5个亚型。研究发现，在转化生长因子（TGF）-β1诱导的成肌细胞分化为肌成纤维细胞过程中，SphK1/S1PR3信号通路发挥关键作用[11]。此外，该信号通路轴也是结缔组织生长因子发挥促纤维化作用的途径[12]。本研究通过推拿手法中的㨰法对股四头肌急性钝挫伤兔进行干预，观察其对股四头肌组织形态和TNF-α含量及SphK1、S1PR3蛋白表达的影响，探讨㨰法促进骨骼肌损伤修复的可能机制，并为㨰法的临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物

新西兰兔15 只（雌性7 只、雄性8 只），体质量2.5～3 kg，湖南中医药大学动物实验中心提供，动物生产许可证号SCXK（湘）2020-0005。饲养于湖南中医药大学动物实验中心普通级动物房，饲养环境由实验室按最适温度和湿度统一控制。适应性饲养7 d开始实验。本实验经湖南中医药大学动物伦理委员会审批（LLBH-202206270004）。

1.2 主要试剂与仪器

兔TNF-α ELISA 试剂盒（湖南艾方生物，货号AF-00660R1），DAPI（武汉Servicebio，货号G1012），HE染液（武汉Servicebio，货号G1005），Masson染液（武汉Servicebio，货号G1006），中性树胶（国药集团，货号10004160），SphK1一抗（武汉三鹰，货号10670-1-AP），S1PR3 一抗（英国Abcam 公司，货号ab126622），β-actin 一抗（武汉Servicebio，货号GB15001），戊巴比妥钠（德国Merck 公司，货号P3761）。病理切片机（上海徕卡仪器有限公司，型号RM2016），组织摊片机（金华市科迪仪器，型号KD-P），包埋机（武汉俊杰，型号JB-P5），掌上离心机（武汉Servicebio，型号D1008E），脱色摇床（武汉Servicebio，型号TSY-B），匀浆仪（武汉康涛科技有限公司，型号KZ-Ⅱ），电泳仪（北京六一仪器厂，型号DYY-6C），酶标仪（美国Bio-Tek，型号Epoch），显微镜（日本尼康，型号Eclipse E100），自制实验动物㨰法器（授权公告号CN216365872U）。

1.3 分组及造模

将15只新西兰兔按随机数字表法分为空白组、模型组和㨰法组，每组5只。参考文献[13-14]方法并改进，采用自制重力锤打击装置制备骨骼肌急性钝挫伤模型。将兔仰卧位固定于兔架上，右后肢内侧剃毛，将厚约1 cm的脱脂棉垫于右后肢股四头肌远心端下方，使其近心端和远心端在同一水平。选取右后肢股四头肌肌腹（约髌底上3.5 cm）中段，以2 cm为直径画圆圈作为打击部位，在打击部位覆盖一层纱布防止皮肤受损。打击时实验人员双手固定兔股四头肌上下端，由专人控制重力锤，使重力锤沿导向管自由下落，同一部位连续打击6次，高度40 cm，打击面积约1.77 cm2，动能3.33 J，冲量2.38 Ns。以打击部位皮肤出现明显肿胀及瘀血，无皮肤受损及骨折，触碰打击部位时有躲避反射为造模成功标准。测量并记录造模后损伤部位距髌底距离。

1.4 干预及取材

造模后第7日，使用本团队前期设计的模拟㨰法实验动物㨰法器（详细介绍见本文OSID码）对㨰法组兔股四头肌损伤处进行干预，最大压力3 N，滚动频率140次/min，3 min/次，上下午各1次，连续3 d。空白组和模型组固定相同时间。末次干预24 h后取材，3%戊巴比妥钠过量麻醉处死兔，选取股四头肌损伤最严重处病灶组织取材，若损伤不明显，则选取造模标记部位组织取材，将组织置于冰上快速分离肌肉和筋膜，并将肌肉组织分成3份，1份置于4%多聚甲醛，另外2份置于-80 °C冰箱保存备用。

1.5 指标检测

1.5.1 HE染色

取出用4%多聚甲醛固定的股四头肌组织，手术刀修剪，放入脱水盒，脱水机内梯度乙醇进行脱水，浸蜡，包埋机包埋，石蜡切片机切片（厚4 μm），将股四头肌石蜡切片依次进行脱蜡，苏木素、伊红染色，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察并采集图像。

1.5.2 Masson染色

股四头肌石蜡切片依次进行脱蜡（二甲苯2次，每次20 min；梯度乙醇2次，每次5 min；水洗），重铬酸钾染色，铁苏木素染色，丽春红酸性品红染色，磷钼酸染色，苯胺蓝染色，1%冰醋酸分化，无水乙醇脱水，二甲苯透明5 min，中性树胶封片，显微镜下观察，采集图像进行分析。

1.5.3 ELISA检测

剪取适量股四头肌组织，加入一定量PBS，匀浆器充分匀浆，3 000 r/min离心20 min，收集上清液。按照试剂盒说明书操作：加样，加酶，温育，配液，洗涤，显色，终止反应，以空白孔调零，波长450 nm测量各孔吸光度（OD值），计算组织中TNF-α含量。

1.5.4 Western blot检测

PBS洗涤股四头肌组织，剪碎后置于匀浆管中，加入匀浆珠、蛋白酶抑制剂、裂解液制成匀浆，冰上裂解30 min，振荡使组织完全裂解，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，收集上清液，经过制胶、蛋白上样、电泳、转膜、封闭、抗体孵育（β-actin 一抗1∶2 000、SphK1一抗1∶3 000、S1PR3一抗1∶3 000，β-actin、SphK1、S1PR3二抗1∶5 000）、显影曝光，以β-actin为内参，AlphaEaseFC处理系统分析目的蛋白相对表达量。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 㨰法干预对模型兔股四头肌病理变化的影响

HE染色显示，空白组兔肌纤维、肌束形态完整，肌细胞排列整齐，细胞核分布于肌膜下方，无炎性细胞浸润；模型组可见肌纤维变形、断裂，肌细胞坏死严重，炎性细胞浸润较明显，由大量结缔组织填充，肌膜模糊、不完整，且肌纤维溶解形成空泡结构，可见少量细胞核居中的新生肌纤维；㨰法组炎性细胞浸润较模型组明显减轻，可见大量细胞核居中且大小不等的新生肌纤维和多核肌管，结缔组织明显减少，肌膜较完整。见图1。

图1 各组兔股四头肌形态（HE染色，×200）

Masson染色中红色表示肌纤维，蓝色表示胶原纤维。空白组兔股四头肌肌纤维排列整齐，可见少量胶原纤维；模型组肌纤维间隙明显增大、排列分散，胶原纤维沉积明显增多，纤维粗大，包绕于肌细胞、肌膜周围，表明纤维化已形成；㨰法组兔肌纤维间隙较模型组减小，肌细胞排列整齐，胶原纤维生成减少。见图2。

图2 各组兔股四头肌形态（Masson染色，×200）

2.2 㨰法干预对模型兔股四头肌组织肿瘤坏死因子-α含量的影响

与空白组比较，模型组兔股四头肌组织TNF-α含量明显增加（P＜0.01）；与模型组比较，㨰法组兔股四头肌组织TNF-α含量明显减少（P＜0.05）。见表1。

表1 各组兔股四头肌组织TNF-α含量比较（±s，pg/g）

表1 各组兔股四头肌组织TNF-α含量比较（±s，pg/g）

注：与空白组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05

TNF-α 2 125.95± 47.47 3 122.25±298.07**2 615.26±365.82#组别空白组模型组㨰法组只数555

2.3 㨰法干预对模型兔股四头肌组织鞘氨醇激酶-1和1-磷酸鞘氨醇受体3蛋白表达的影响

与空白组比较，模型组兔股四头肌组织SphK1、S1PR3蛋白表达明显升高（P＜0.01）；与模型比较，㨰法组兔股四头肌组织SphK1、S1PR3蛋白表达明显降低（P＜0.05）。见图3、表2。

表2 各组兔股四头肌组织SphK1、S1PR3蛋白表达比较（±s）

表2 各组兔股四头肌组织SphK1、S1PR3蛋白表达比较（±s）

注：与空白组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05

S1PR3 0.434±0.103 0.956±0.190**0.739±0.114#组别空白组模型组㨰法组只数555 SphK1 0.301±0.134 1.034±0.127**0.775±0.138#

图3 各组兔股四头肌组织SphK1、S1PR3蛋白免疫印迹

3 讨论

骨骼肌急性钝挫伤是由钝器造成的机械损伤，常引起肌细胞受损、毛细血管破裂及浸润性出血、水肿、炎症等。此外，由于血管和周围组织广泛受损，氧气和营养物质无法到达神经和肌肉细胞，组织损伤将进一步加重[15]。骨骼肌损伤包括炎症、再生和纤维化3个阶段[16]，损伤后的炎症反应和纤维化是骨骼肌修复的必经过程。促炎因子过表达会加剧肌肉损伤，通过正反馈通路增强炎症反应[17]。过度纤维化也是影响肌肉愈合的主要障碍，骨骼肌纤维化由细胞外基质过度沉积引起，导致骨骼肌功能和活动受限，影响肌肉损伤后再生；此外，纤维化还增加了肌肉损伤的易感性，易发生再次损伤[18-20]。因此，降低骨骼肌炎症反应及纤维化，促进骨骼肌细胞再生是促进骨骼肌损伤后修复的重要研究方向。

TNF-α是参与炎症反应的促炎因子之一，在组织损伤初期，TNF-α水平升高，并且由于其对细胞坏死的作用而持续升高[17]。研究表明，高水平TNF-α可能导致成肌细胞和肌细胞凋亡，从而导致肌肉萎缩[21]。SphK1/S1P/S1PR信号通路被认为是治疗癌症和炎症性疾病的关键通路[22]。TNF-α 能激活位于细胞质的SphK1，活化的SphK1易位到质膜上，催化鞘氨醇磷酸化生成S1P[23]。在L929成纤维细胞和A549肺癌细胞中，TNF-α诱导的环氧合酶-2表达上调及促炎介质前列腺素E2的产生依赖SphK1的激活和S1P的合成[24]。此外，TNF-α诱导特定细胞因子、趋化因子和黏附分子（如IL-6、RANTES、MCP-1和VCAM-1）的转录也需要SphK1 的激活[25]。TNF-α 受体相关因子2（TRAF2）是TNF-α信号传导的重要中间体，SphK1含有TRAF2 结合位点[26]，其直接与TRAF2 结合产生S1P，S1P在N端指环结构域与TRAF2结合，促进赖氨酸-63连接的受体相互作用蛋白多泛素化、IκB激酶和IκBα磷酸化及IκBα降解，从而导致核因子-κB激活[27]。因此，抑制TNF-α/SphK1/S1P信号传导对减轻炎症具有重要意义。此外，SphK1与组织纤维化也密切相关，SphK1能够促进基质金属蛋白酶抑制剂-1表达，从而抑制细胞外基质降解[28]；抑制SphK1表达导致TGF-β刺激胶原蛋白生成受阻，还可能诱导成纤维化细胞凋亡，从而减少纤维化[29-30]。S1P异常激活会促进炎症、纤维化等发生[30]，活化的S1P主要与S1PR发生一系列反应[31]，敲除S1PR2、S1PR3或SphK1均可抑制TGF-β1诱导的体外肌成纤维细胞分化[32]；S1P在臀肌挛缩患者肌肉中表达升高，外源性S1P刺激可以促进成纤维细胞增殖，增加胶原和其他纤维化因子的合成[33]。S1PR3参与不同组织如骨骼肌、肺脏和肝脏的纤维化发展[11，34-35]，S1PR3及其下游信号通路被认为是成肌细胞分化为肌成纤维细胞的候选靶点[36]，而肌成纤维细胞在纤维化发生中起主要作用[37]。因此，纤维化的发生也与SphK1/S1P/S1PR3信号通路密切相关。

本研究结果显示，骨骼肌损伤后，模型组兔股四头肌组织TNF-α含量及SphK1、S1PR3表达明显高于空白组，HE染色显示炎性细胞浸润较明显，肌纤维变形断裂，肌细胞坏死严重，肌膜模糊不完整，且有肌纤维溶解后形成的空泡结构，可见少量新生肌纤维，Masson染色显示大量胶原纤维，说明造模成功。㨰法组兔股四头肌组织TNF-α含量及SphK1、S1PR3表达明显低于模型组，HE染色可见炎性细胞浸润较模型组明显减轻，有大量新生肌纤维和多核肌管，Masson染色显示胶原纤维较模型组明显减少，提示㨰法可能通过降低TNF-α含量，减少SphK1激活和下游因子S1P产生，进而抑制细胞内S1P介导的核因子-κB激活，并阻断S1P与S1PR3的信号传导，从而发挥减缓炎症和纤维化的作用。

综上所述，㨰法干预能抑制骨骼肌急性钝挫伤兔受损组织TNF-α含量SphK1、S1PR3表达，减轻炎症反应，减缓组织纤维化，促进肌细胞新生，从而促进骨骼肌损伤后修复。本研究可为㨰法治疗骨骼肌损伤提供实验依据，㨰法对TNF-α/SphK1/S1PR3信号通路的上下游调节机制仍待进一步探索。