山楂叶配方颗粒与标准汤剂药效等效性研究

高静云，李艳荣，赵胜男，杜义龙，高 晗，潘海峰

（1.承德医学院河北省中药研究与开发重点实验室，河北承德 067000；2.神威药业集团有限公司）

中药配方颗粒是以中医药理论为指导，采用现代技术将中药饮片制成可供临床配方使用的颗粒剂[1]。作为传统中药饮片的补充与创新，具有免煎煮、服用方便、易于调剂等优点[2,3]。近年来，中药配方颗粒越来越受到人们的关注。然而，中药配方颗粒与中药汤剂在药理药效以及临床疗效上是否一致，一直备受争议。因此，开展中药配方颗粒与中药汤剂的药效等效性研究具有重要意义。

山楂叶含有黄酮、有机酸等活性成分[4-7]。药理研究表明，山楂叶在心脑血管、抗氧化等方面具有良好作用[8]。临床上多以片剂、胶囊剂等用于疾病的治疗[9,10]，但关于山楂叶配方颗粒的研究较少。因此，本文对山楂叶配方颗粒和标准汤剂的等效性进行研究，为山楂叶配方颗粒的开发和应用提供依据。

1 材料与仪器

1.1 细胞株

人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，购于美国Sciencell公司。

1.2 药物与试剂

对照品(牡荆素葡萄糖，批号：20042305；牡荆素鼠李糖苷，批号：20042304；金丝桃苷，批号：19103001；异槲皮素，批号：18062702纯度＞98%)，成都普菲得生物技术有限公司；胎牛血清、DMEM培养基，武汉普诺赛公司；MDA检测试剂盒，碧云天生物技术有限公司；SOD、LDH检测试剂盒，南京建成生物工程研究所；维生素E(vitamin E)，北京博奥拓达科技有限公司；山楂叶中试配方颗粒(S1～S3)，神威药业集团有限公司；山楂叶标准汤剂(S1～S3)，承德医学院中药研究所。

1.3 仪器

Agilent 1200高效液相色谱仪，美国安捷伦公司；JA5003上皿天平（千分之一），天津天马衡基仪器有限公司；AG225电子分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司；KQ-700超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；HC-2062高速离心机，科大创新股份有限公司中佳分公司；FW100高速万能粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司。

2 方法

2.1 山楂叶配方颗粒与标准汤剂主要化学成分含量比较

2.1.1 色谱条件[11]色谱柱品牌及型号：Agilent ZORBAX SB-C18，规格：4.6mm×250mm，粒径：5μm；柱温：30℃；流速：1.0mL/min；检测波长：340nm；进样体积：10μL。流动相：0.1%甲酸水(A)-乙腈(B)-四氢呋喃(D)，洗脱程序见表1。

表1 流动相梯度洗脱系统

2.1.2 供试品溶液的制备 精密称量0.5g山楂叶配方颗粒及标准汤剂，置于具塞三角瓶中，加入50mL的60%甲醇，密封称定。超声提取(40KHz，700W)，恢复室温后再次称定，60%甲醇补足失重。0.45μm滤膜过滤，即得。

2.1.3 对照品溶液的制备 精密称取适量牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、金丝桃苷和异槲皮素对照品，甲醇溶解、定容，即得浓度分别为1.018mg/mL、1.015mg/mL、1.067mg/mL、1.037mg/mL、0.4132mg/mL的对照品储备液。取适量各对照品储备液，置于容量瓶中，以50 % 甲醇溶解、稀释，即得每1mL中含有牡荆素葡萄糖苷80.2µg、牡荆素鼠李糖苷115.8µg、金丝桃苷35.3µg和异槲皮素12.4µg的混合对照品溶液。

2.1.4 线性关系 按照“2.1.1”色谱条件，测定了不同浓度水平对照品溶液中各色谱峰的峰面积，得到牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、金丝桃苷和异槲皮素的回归方程分别为Y=11.237X-0.9696(R2=1)，Y=1.237X-0.9696(R2=1)，Y=11.892X-1.8951(R2=1)，Y=20.33X-10.354(R2=1)。线性范围分别为3.17～203μg/mL，5～320μg/mL，2.11～134.81μg/mL和0.97～61.98μg/mL，线性关系良好。

2.1.5 样品测定 按照“2.1.1”条件下的色谱条件，在高效液相色谱仪设定上样体积为10μL，测定并记录高效液相色谱图。将山楂叶配方颗粒与标准汤剂的高效液相色谱图与混合对照品的图谱进行比较。根据各对照品的保留时间和峰面积，计算配方颗粒与标准汤剂中牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、金丝桃苷和异槲皮素4个化学成分的含量，比较其化学成分的差异。结果见表2。

表2 山楂叶配方颗粒与标准汤剂中牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、金丝桃苷和异槲皮素含量表(%)

2.2 山楂叶配方颗粒与标准汤剂抗氧化应激活性的比较

2.2.1 细胞培养与药物配置 取对数生长期的细胞，用含有10%的胎牛血清、1%的青链霉素的DMEM培养液，置于37℃，5%CO2的培养箱中培养24～48h传代一次。分别精密称取相当于山楂叶2.0mg的配方颗粒(n=3)与山楂叶标准汤剂(n=3)，DMSO溶解，配置成10g/L的储备液，置于4℃冰箱内保存，备用，使用时用DMEM培养液稀释。精密称取10mg维生素E，蒸馏水溶解，置于4℃冰箱内保存，备用，使用时稀释成浓度为25μg/mL。

2.2.2 实验分组及给药 取对数生长期的细胞，用DMEM培养液将细胞稀释为6×105/mL的密度，以每孔100μL接种于96孔板，5个复孔。另取细胞原液稀释为1×105/mL，以每孔2mL接种于6孔板中，3个复孔。并置于37℃，5%CO2的培养箱中培养。贴壁24h后待HUVEC细胞达80%以上进行实验。将细胞随机分为正常组、模型组(H2O2)、阳性药组(vitamin E)及给药组。按分组加入适量药物后置于37℃，5%CO2培养箱中孵育。

2.2.3 建立HUVEC 细胞氧化损伤模型：按“2.2.2”项下方法接种细胞于96孔板，贴壁24h。将孔内液体换为无血清的高糖培养液，设空白对照组：加入DMEM培养液；不同浓度H2O2模型组：加入终浓度分别为100μmol/L、200μmol/L、400μmol/L、600μmol/L、800μmol/L和1000μmol/L的H2O2，放于培养箱中培养3h，用CCK8法筛选出建立氧化损伤模型最合适的H2O2浓度。

2.2.4 山楂叶配方颗粒与标准汤剂作用时对HUVEC细胞的影响 按“2.2.2”项下方法接种细胞于96孔板，贴壁24h。除去细胞培养液，正常组每孔加入100μL DMEM培养液，给药组分别加入100μL的浓度的山楂叶配方颗粒(50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL和800μg/mL)与标准汤剂(50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL和800μg/mL)，置于培养箱中培养24h。用CCK8法测定出不同浓度的山楂叶配方颗粒与标准汤剂对HUVEC细胞的影响，实验重复3次。

2.2.5 山楂叶配方颗粒与标准汤剂对氧化损伤后 HUVEC细胞的影响 按“2.2.2”项下方法接种细胞于96孔板，贴壁24h。除去细胞培养液，除正常组外，其他各组每孔加入100μL H2O2(600μmol/L)，孵育3h，获得H2O2氧化损伤模型。除去培养液，PBS洗涤两次，正常组与模型组每孔加入100μL DMEM培养液，阳性组加入25μg/mL的维生素E，给药组分别加入50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL和800μg/mL的山楂叶配方颗粒与标准汤剂100μL，置于培养箱中培养24h。用CCK8法测定出不同浓度的山楂叶配方颗粒与标准汤剂对 HUVEC 细胞的影响，筛选出最佳治疗浓度进行后面的对比实验，实验重复3次。

2.2.6 HUVEC 细胞中 LDH、MDA 和 SOD 含量的测定 按“3.2”项下方法分别接种细胞96孔板及6孔板，贴壁24h，按分组给药。按照乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase，LD或LDH)试剂盒说明书进行检测。收集6孔板中细胞，进行消化、计数、离心后弃上清，按照每100万细胞加入100μL细胞裂解液，吹打使其充分裂解。12000r/min，离心10min，取上清，备用；按照丙二醛(malondialdehyde，MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD) 试剂盒说明书进行检测，实验重复3次。

2.2.7 统计学分析 采用GraphPad Prism 9.0软件进行数据分析以及绘图，统计结果采用单因素方差分析。实验结果表示为平均值±标准差()，以P＜0.05表示具有统计学意义。

3 结果

3.1 山楂叶配方颗粒与其标准汤剂主要化学成分含量的比较

用高效液相色谱法测定3批山楂叶配方颗粒和3批山楂叶标准汤剂中牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、金丝桃苷和槲皮素含量，如表1所示。结果发现，山楂叶配方颗粒和标准汤剂中的这5个化学成分的含量均无显著性差异(P＞0.05)，说明山楂叶配方颗粒和标准汤剂中主要成分的含量相当，具有一致性。

3.2 H2O2对正常 HUVEC细胞存活率的影响

H2O2浓度越高，细胞存活率越低。其中600μmol/L时，细胞存活率接近50%，因此选择该浓度作为H2O2建立氧化应激损伤模型的最佳浓度。

3.3 山楂叶配方颗粒与其标准汤剂对正常HUVEC细胞存活率的影响

结果显示，给予正常细胞不同浓度的山楂叶配方颗粒及其标准汤剂(50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL和800μg/mL)，处理24h，测定其相对存活率均大于90%，且二者相比，无统计学意义(P＞0.05)。表明山楂叶配方颗粒与标准汤剂对正常的HUVEC细胞活性无不良影响，且具有一致性。细胞存活率折线图见图1。

图1 山楂叶配方颗粒与标准汤剂对细胞的影响

3.4 山楂叶配方颗粒与标准汤剂对氧化损伤HUVEC细胞的影响

结果表面，与正常对照组比较，模型组存活率显著降低(P＜0.05)，表明造模成功。与模型组比较，维生素E阳性组、山楂叶配方颗粒与标准汤剂100μg/mL、200μg/mL和400μg/mL浓度组均能使细胞存活率升高 (P＜0.05)，山楂叶配方颗粒和标准汤剂各组间比较无显著性差异(P＞0.05)。其中当浓度为400μg/mL时，治疗效果最好，后续实验以此浓度进行。与阳性组比较，作用高于维生素E。各组细胞活性折线图见图2。

图2 山楂叶配方颗粒与标准汤剂对氧化损伤HUVEC细胞的影响

3.5 山楂叶配方颗粒与标准汤剂对氧化损伤HUVEC细胞中LDH、MDA、SOD的影响

结果如图3所示，与正常组比较，模型组LDH、MDA水平显著升高(P＜0.01)，SOD水平显著降低(P＜0.01)。与模型组比较，维生素E阳性组、山楂叶配方颗粒与标准汤剂给药组均能使 LDH、MDA 水平显著降低 (P＜0.01)，SOD水平显著升高(P＜0.01)。山楂叶配方颗粒和标准汤剂组间的抗氧化活性无显著性差异(P＞0.05)。与阳性组比较，作用优于维生素E。

图3 山楂叶配方颗粒与标准汤剂对H2O2损伤的 HUVEC细胞中LDH(A)、MDA(B)、SOD(C)的影响

4 讨论

山楂叶主要活性成分为黄酮类化合物[12]，前期试验证实了山楂叶标准汤剂[13]和山楂叶提取物[14]中黄酮类成分有较好的体外抗氧活性，是山楂叶发挥抗氧化活性的主要成分和物质基础。因此，本试验测定和对比了山楂叶配方颗粒和标准汤剂中含量较高的牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、金丝桃苷和异槲皮素4个黄酮类成分的含量。结果显示，这4个化学成分含量没有明显差异，表明配方颗粒在制备过程中保留了山楂叶的主要活性成分，与标准汤剂基本一致，为进一步开展药效等效性研究提供了物质基础。

氧化应激是由于机体或细胞的氧自由基产生与清除失衡，导致机体和细胞发生氧化损伤，此时机体细胞中存在LDH水平升高，MDA含量增加和SOD活性下降的现象[15,16]。LDH的释放量可反映细胞的损伤程度，MDA的水平可反映细胞受自由基攻击的严重程度，SOD的活性可反映机体清除氧自由基的能力。因此LDH、MDA和SOD可作为氧化应激指标，反映细胞氧化损伤程度[17]。本试验考察了山楂叶配方颗粒和标准汤剂在HUVEC细胞中抗氧化活性的最佳浓度，而当两者浓度为400μg/mL时效果最佳。最终表明山楂叶配方颗粒与标准汤剂均能降低H2O2诱导的HUVEC细胞释放的LDH和MDA，并能提升SOD的活性，且效果相当，表明山楂叶配方颗粒和标准汤剂在抗氧化活性方面具有等效性。

本文在主要活性成分含量一致性以及体外抗氧化活性等效性方面对山楂叶配方颗粒和标准汤剂进行了研究，为配方颗粒在临床上更好的应用提供了重要的理论依据。