蜱传人兽共患无形体和立克次体的分子生物学鉴定

任 晴，李美辰，张家铭，杜娈英，郭文平*，谢广成*

(1.承德医学院基础医学院，河北承德 067000；2.秦皇岛市第一医院)

立克次氏体目（Rickettsiales）在分类上属于α变形杆菌纲细菌，是严格寄生在真核细胞内的原核细胞型微生物。立克次氏体目细菌主要通过蜱、跳蚤和螨类等节肢动物传播媒介将病原体传播给人类，引起人兽共患性传染病[1]。蜱是专性寄生在哺乳动物体表的吸血节肢动物，所传染的疾病多为自然疫源性疾病，易在自然界流行。在过去几十年里，蜱传疾病的发病率在全球范围内不断增加，在中国内陆已发现了33种蜱相关病原体，据报道[2]有15种可引起人类感染。作为立克次氏体目细菌重要的传播媒介，由蜱传播且可引起疾病的立克次氏体目细菌主要包括无形体科中的无形体（Anaplasma）、埃立克体（Ehrlichia）、新埃立克体（CandidatusNeoehrlichia）以及立克次体科立克次体属（Rickettsia）。可引起人类感染的蜱传无形体包括羊无形体（A. ovis）、山羊无形体（A. capra）、扁平无形体（A. platys）和嗜吞噬细胞无形体（A. phagocytophilum）等[3]；埃立克体主要为查菲埃立克体（E. chaffeensis）和新埃立克体中的米库尔新埃立克体（CandidatusN. mikurensis）。引起人类感染的蜱传立克次体主要包括斑点热群（spotted fever group rickettsia, SFGR）中的黑龙江立克次体（R. heilongjiangiensis）、西伯利亚立克次氏体（R. sibirica）、饶氏立克次体（R. raoultii）以及近年来新发现的新塔拉塞维奇立克次体等[4]。我国是受立克次体目细菌相关疾病严重影响的国家，上述病原体在蜱、储存宿主以及患者中均有发现，严重威胁着我国的公共卫生安全[5]。

承德市近年来旅游业发展迅速，人们的生活和工作环境经常侵入到蜱的生活地，加大了蜱媒病原体的传播风险。然而，承德地区蜱源立克次体疾病与无形体疾病的报道甚少。本研究采用分子流行病学研究的方法对承德地区蜱携带的立克次体、无形体的情况进行调查，分析承德地区人兽共患无形体和立克次体种类及其遗传特征，为蜱源立克次氏体目细菌引起相关疾病的防控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与设备

DNA提取试剂盒（美国OMEGA生物技术公司），凝胶纯化回收试剂盒（北京全式金生物技术有限公司），2×PCR Taq Mix（北京全式金生物技术有限公司），DL2000 DNA Marker（北京擎科新业生物技术有限公司）。

超净工作台（上海智城分析仪器制造公司），PCR基因扩增仪（美国Bio-Rad公司），核酸电泳仪（美国Bio-Rad公司），Gel Doc凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司），4℃离心机（美国Thermo公司）。

1.2 蜱的采集

2020年4月～2020年8月，在承德市周边的三沟镇和六沟镇采集蜱标本。随机选择自然放养的家畜，如牛、山羊和绵羊等，在其体表用镊子采集蜱，每个动物体表只采集1只蜱。采集的蜱经形态学鉴定后，用分子生物学的方法进行病原体的检测。

1.3 蜱DNA的提取

将采集到的蜱放置于75%乙醇溶液中，浸泡10 min后再用PBS缓冲液冲洗3次，待自然干燥后以单只蜱为一组置于1.5 mL离心管中。DNA的提取按照试剂盒提供的步骤进行提取，提取后的总DNA 50μL，放置于-20 ℃冰箱保存备用。

1.4 无形体与立克次体的分子生物学检测与鉴定

为了增强扩增产物的特异性，提高检测的灵敏度，使扩增结果更准确，本实验采用巢式PCR扩增无形体科和立克次体属的16S rRNA基因进行病原体的检测，检测的引物序列见表1。PCR的反应体系如下：第1轮PCR反应采用20 μL的反应体系，包括2×Taq DNA聚合酶10 μL，上下游引物各0.8 μL（10 μmol/L），DNA模板1 μL，加ddH2O补足至20 μL。PCR的反应条件为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性40s，50℃退火40s，72 ℃延伸50s，共35个循环；72 ℃终延伸7 min。待第1轮反应结束后，以第1轮的PCR产物为模板进行第2轮PCR反应，反应条件同第一轮。反应体系为40 μL：2×Taq DNA聚合酶20 μL，上下游引物各1.6 μL（10 μmol/L），DNA模板2.5 μL，加ddH2O补足至40 μL。

表1 本研究中用到的引物

扩增groEL进行无形体属物种的鉴定，扩增外膜蛋白A（ompA）基因进行立克次体的鉴定（表1）。PCR扩增同上述扩增16S rRNA基因的体系与程序。

1.5 序列测定与同源性比对分析

PCR反应结束后，取5μL PCR产物在1.2%琼脂糖凝胶上电泳，然后使用凝胶成像仪观察电泳结果，将符合目的条带大小的PCR产物用DNA纯化试剂盒进行回收，回收产物送至上海生工生物工程有限公司进行基因测序。将测序获得的序列在美国国立生物技术信息中心（NCBI）进行BLASTn比对。采用DNAstar软件进行同源性分析，采用MEGA7.0软件进行最佳核酸替代模型计算与系统发育分析。使用最大似然法构建系统发生树，并进行Bootstrap验证，分析采用1000次。

1.6 统计学分析

计数资料以(n,%)表示，使用SPSS 22.0统计软件进行χ2检验和统计学显著性差异分析，以P＜0.05为具有显著统计学差异。

2 结果

2.1 蜱感染无形体和立克次体的流行情况

本研究在承德六沟镇和三沟镇共采集到336只蜱样本，其中六沟镇192只，三沟镇144只。经形态学鉴定，所有蜱样本均为长角血蜱。经巢式PCR扩增16S rRNA、测序以及BLASTn搜索比对，在承德六沟镇和三沟镇检测出无形体属样本共85份。其中，六沟镇蜱感染无形体的阳性率为31.3%（60/192），三沟镇的阳性率为17.4%（25/144），六沟镇蜱感染无形体的阳性率显著高于三沟镇（P=0.004）。另外，共检测到立克次体阳性样本58份，其中六沟镇蜱感染立克次体的阳性率为15.1%（29/192），三沟镇的阳性率为20.1%（29/144），三沟镇蜱感染立克次体的阳性率显著高于六沟镇（P=0.02）。总的来看，两个镇蜱感染无形体的阳性率为25.3%（85/336），立克次体的阳性率为17.3%（58/336），蜱感染无形体的阳性率显著高于立克次体（P=0.01）。

2.2 蜱感染无形体和立克次体的物种鉴定及进化分析

为了进一步确定无形体和立克次体的物种，分别扩增了groEL基因与ompA基因进行鉴定。在groEL基因构建的系统进化树上，本研究中扩增到的所有序列分成两个进化分支。第一个进化分支包括来自28个阳性标本的序列，与山羊无形（A. capra）之间的亲缘关系最近（图1）。这28条序列之间的同源性为99.5%～100%，与山羊无形体已知groEL基因序列之间的同源性为99.67%～100%。第二个进化分支包括来自57个阳性标本的序列，与羊无形体之间的亲缘关系最近（图1），这57条序列之间的同源性是99.50%～100%，与羊无形体已知groEL基因序列之间的同源性为99.31%～100%。根据groEL基因序列的同源性与系统发生分析，本研究中检测到的无形体分别是山羊无形体和羊无形体，阳性率分别为8.3%和17.0%，具有显著的差异性（P=0.0001）。

图1 根据groEL基因序列构建的系统进化树

在立克次体ompA基因部分核苷酸序列构建的系统进化树上，发现本研究中扩增到的58条序列分成3个进化分支（图2）。第一个进化分支包括12条序列，与西伯利亚立克次体（R. sibirica）的亲缘关系最近。这12条序列之间的同源性为99.1%～100%，与西伯利亚立克次体之间的同源性为99.63%～100%。第二个进化分支包括25条序列，与Ca. R. jingxinensis 暂定种和河北立克次体（Ca.R.hebeiii）的亲缘关系最近。这25条序列之间的同源性是99.90～100%，与Ca. R. jingxinensis暂定种和河北立克次体的ompA基因序列之间的同源性为99.30%～100%。第三个进化分支包括21个阳性标本，与饶氏立克次体的亲缘关系最近。这21条序列之间的同源性为99.6%～100%，与饶氏立克次体之间的同源性为99.93%～100%。根据ompA基因序列的同源性与系统发生分析，本研究中检测到的立克次体包括3种，分别是西伯利亚立克次体、Ca. R.jingxinensis和饶氏立克次体，阳性率分别为3.6%、7.4%和6.3%。Ca. R. jingxinensis和饶氏立克次体显著高西伯利亚立克次体（P＜0.05）。

图2 根据ompA基因序列构建的系统进化树

3 讨论

我国流行的蜱传立克次氏体目细菌种类众多，其中多数是人兽共患病的病原体。此外，传播这些病原体的蜱种包括硬蜱属、血蜱属、扇头蜱属、革蜱属中的五十余种蜱[9]。河北省幅员辽阔，地形地貌多种，适合蜱的生存，目前至少发现了17种蜱[10]。虽然蜱的种类众多，但河北省关于蜱传立克次体目细菌的研究较少，目前只报道了河北立克次体的流行[11]。本研究中从承德市周边三沟镇和六沟镇的农村地区采集的蜱种均为长角血蜱，是通过吸血将立克次氏体目细菌传播给人类和脊椎动物的主要媒介[9]。在本研究中，我们通过分子生物学的方法对立克次氏体目细菌进行检测，共检测到羊无形体、山羊无形体、西伯利亚立克次体、Ca. R. jingxinensis和饶氏立克次体在内的5种立克次氏体目细菌。更为重要的是，这5种立克次氏体目细菌均是能感染人的人兽共患病原体。

2015年我国学者首次报道了我国黑龙江省人感染山羊无形体的病例[12]，此后，分子流行病学调查显示其在我国广泛分布[2]。2010年，羊无形体被首次报道可以感染人，是人兽共患病的病原体，但迄今为止有关羊无形体感染人的报道较少[13]。羊无形体在我国分布更广，几乎大部分的省份均有报道[2]。山羊无形体和羊无形体的传播媒介比较类似，包括硬蜱属、血蜱属、扇头蜱属和革蜱属中的多个蜱种[2]。在本研究中，经过groEL基因序列的同源性与系统进化分析，承德地区周边农村流行的无形体主要为山羊无形体和羊无形体，并且携带率较高。虽然我国尚无人感染羊无形体的报道，但其在蜱中的感染率较高，应加强对羊无形体的流行监测。长角血蜱是羊无形体和羊无形体的传播媒介，并且其为三宿主蜱，居住在农村地区的人与蜱接触的可能性更大，更容易被感染，因此需要进一步开展人感染无形体的监测来评估这些无形体对人的健康所造成的威胁。

研究[2,11]显示，河北省张家口市、唐山市和秦皇岛市的长角血蜱中发现了一个立克次体新种，后被命名为河北立克次体，阳性率为6.7%～7.9%，但在承德采集的长角血蜱中没有检测该立克次体。本研究发现承德地区立克次体的阳性率为17.3%，明显高于周边城市，表明立克次体在承德地区可能是一个日益严重的公共卫生问题。Ca.R.jingxinensis和Ca. R. longicornii是立克次体中的两个暂定种，课题组前期研究显示二者实为一个物种[14]。在本研究中，我们经过同源性与系统进化分析发现河北立克次体与上述两个物种也应为同一个物种。因此，本次研究共发现3种蜱传立克次体，分别为西伯利亚立克次体、Ca.R. jingxinensis和饶氏立克次体。尤为重要的是，这3种立克次体均可感染人，并且在我国都有感染人的报道[2,15]，是对我国影响比较大的立克次体种类。本研究结果提示，承德地区应加强不明原因发热的病人中立克次体的监测，以期更好地预防和控制该地区蜱与蜱媒疾病。

本研究明确了承德农村地区媒介蜱种与立克次氏体的种类，确定流行的立克次氏体目细菌的遗传多样性，所得到的研究结果为承德地区蜱传立克次体的预警和防控提供科学依据。