伊犁河游流域可培养水生真菌多样性及胞外酶活性

2023-06-10胡海洋

西南农业学报 2023年4期

胡海洋,彭亮,程艳,程刚, 4,邢月

(1.新疆农业大学水利与土木工程学院,乌鲁木齐 830052;2.新疆环境污染监控与风险预警重点实验室,乌鲁木齐 830012;3.新疆环境保护科学研究院,乌鲁木齐 830012;4.上饶师范学院生命科学学院,江西上饶 334003;5.新疆农业大学化学化工学院,乌鲁木齐 830000)

【研究意义】真菌在水生生态系统中可作为分解者参与有机物的分解和代谢,同时在水体能量流动和营养物质的循环和转换中扮演着重要角色[1-2]。水生真菌广泛存在于水生生态系统中,在静态水(湖泊、水库、人工湖等)和动态水(河流、小溪、水沟等)环境中均可存在[3-4]。作为水生生态环境中的分解者,水生真菌能够通过胞外酶等形式分解和代谢水环境中的有机物质并释放营养和次级代谢产物,从而以不同方式影响着水生生态系统中食物网结构、物质和能量流动。因此研究水生真菌的多样性及胞外酶活性对指导水生生态系统的健康可持续发展以及预测环境变化对生态系统的潜在影响具有重要意义。【前人研究进展】近年来,产胞外酶真菌对环境中大颗粒物质的催化水解及作用机理研究备受关注,Payne等[5]对纤维素降解真菌产酶条件及应用范围进行了初步探究。罗春雷等[6]和Fan等[7]对淀粉酶的分类及水解类型进行调查研究,发现淀粉酶被广泛应用于各个行业中。陈洪洋等[8]对木聚糖酶的产生菌及如何提高木聚糖酶的酶活性进行了研究。武善军[9]则对产木质素降解酶的真菌及其发酵条件进行研究,找出了最佳的产酶条件。而产纤维素酶、淀粉酶、酯酶和木聚糖酶的降解真菌主要以青霉属(Penicillium)和曲霉属(Aspergillus)为主[10-13]。大量研究已从水生生境中分离得到具有潜在应用价值的产胞外酶真菌[14-15]。【本研究切入点】伊犁河流域是新疆水资源最丰富的内陆河流域之一[16],流域地处西北内陆干旱区,自然地理、气候条件及人类活动特征与中东部地区差异显著,其水生态系统中微生物类型和多样性在西北内陆区具有典型性和代表性;而目前有关流域水生微生物,尤其是水生真菌种类及胞外酶活性研究尚属空白。【拟解决的关键问题】本研究针对伊犁河流域主要干支流水体及沉积物的可培养真菌多样性及胞外酶活性进行调查分析,以期摸清该区域内可培养真菌的种类、分布、优势门属等信息,筛选潜在功能性真菌菌株,挖掘和储备研究区具有水环境净化和污水高效降解的真菌菌种资源,为流域水环境保护和水污染治理提供科学参考依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集

选取伊犁河三支一干(特克斯河、喀什河、巩乃斯河及伊犁河干流)水体和沉积物作为研究对象,平均约每50 km设置1个采样点,全流域共设置15个点位,其中特克斯河、喀什河和伊犁河干流分别设置4个采样点,巩乃斯河设置3个采样点,每个样点采集水体和沉积物样品各1份。于2021年7—8月,在伊犁河流域进行样品采集,将采集的样品装在50 mL无菌离心管内,4 ℃低温保存并运输至实验室备用。

1.2 培养基制备

分离培养基:PDA培养基、沙氏培养基、YPD培养基、虎红培养基[21]。本试验选择的胞外酶有淀粉酶、纤维素酶、酯酶、明胶酶、木聚糖酶、木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、漆酶培养基和偶氮还原酶,相关培养基的配置和胞外酶活性筛选参照相关文献[17-22]的方法并做适当修改。

1.3 真菌的分离培养及菌种保藏

水样和沉积物样品采用稀释涂布平板法,将各支流微生物取样点的水体(1 mL)和沉积物(15 g左右)等量混合,用0.85%生理盐水依次稀释到10-1、10-2,每个稀释度取0.2 mL涂布于4种分离培养基平板上,于26 ℃培养5～7 d,根据菌落形态、色泽的差异,挑取形态差异较大的单菌落转接纯化2～3次。挑取纯化后的单菌落,用含40%甘油的分离纯化培养基-80 ℃下保种。

1.4 真菌鉴定及系统发育树构建

1.4.1 真菌ITS区基因序列扩增将筛选纯化的菌株在培养基上培养5～7 d后,刮取50 mg左右菌苔放至2 mL离心管内,参照真菌基因组DNA提取试剂盒(上海生工生物工程股份有限公司)的操作说明书提取真菌DNA。

纯化真菌ITS区段的序列扩增使用真菌通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。PCR反应体系(25 μL):双蒸水16 μL,10×PCR Buffer 2.5 μL,dNTP Mixture 2 μL,rTaq0.5 μL,引物各1 μL,模板DNA 2 μL。PCR扩增程序参照魏超等[23]的方法进行并做适当修改[23]。PCR扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测,选择有特异性明亮条带的PCR产物送上海生工生物工程股份有限公司测序。

1.4.2 系统发育分析与数据处理将纯化真菌的ITS区基因测序结果进行BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi)同源性比对,获得最相近模式菌株的ITS区基因序列。利用MEGA 7.0软件进行系统发育分析,根据Kimura的双参数模型计算系统进化矩阵,采用最大似然法(Maximum likelihood method)构建系统进化树[24]。并将纯化真菌测序结果上传至GenBank数据库,获取待测菌株的注册号。

伊犁河流域可培养真菌α多样性指数(Simpson、Shannon-Wiener多样性指数、Magalef丰富度指数和Pielou均匀度指数)的计算采用Excel 2019软件,具体公式参考郭小芳等[25]的方法进行计算。

2 结果与分析

2.1 伊犁河流域可培养真菌菌群组成

从伊犁河流域采集的水体和沉积物样品中共分离得到248株真菌。根据菌落形态结合ITS区基因比对结果,将248株可培养真菌划分为3个门,11个纲,26个目,44个科,82个属,其中菌株F-1(OM638712)只鉴定到柔膜菌目(Helotiales),菌株F-119(OM648169)只鉴定到肉座菌目(Hypocreales);菌株F-222(OM647879)只鉴定到Plectosphaerellaceae科,菌株F-232(OM670130)只鉴定到Cistella科(表1)。4株可培养真菌菌株(F-5、F-13、F-56、F-97)的BLAST比对结果最高相似率低于98%(表1,加粗标出),初步确定为潜在新物种,值得开展多项分类学研究来明确其系统分类地位。对部分代表菌株与相应的模式菌株构建系统发育树(图1)。在门水平上,248株菌株分属于子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)和毛霉菌门(Mucoromycota)。其中,子囊菌门为优势门,占总分离菌株的87.10%,分属于61个属4个潜在的新类群,是伊犁河流域真菌的主要类群;其次是担子菌门,共分离得到28株,占比为11.66%。在属水平上,优势菌属为青霉属(Penicillium),占总分离菌株的7.26%;其次是枝孢霉属(Cladosporium),占总分离菌株的6.85%;随后是木霉属(Trichoderma),占总分离菌株的5.65%;然后是镰刀菌属(Fusarium),占总分离菌株的4.44%;最后是小球腔霉属(Leptosphaeria)和茎点霉属(Phoma),都占总分离菌株的4.03%。上述结果表明,伊犁河流域水环境中具有丰富多样的水生真菌。

图1 伊犁河流域部分真菌ITS区基因序列系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree of ITS region gene sequences of some fungi in the Ili River basin

表1 伊犁河流域可培养真菌ITS区基因序列相似性Table 1 ITS region gene sequence similarity of culturable fungi in the Ili River basin

2.2 伊犁河流域真菌分布特征

流域水体和沉积物分离出的可培养真菌多样性具有明显差异,水体中共分离得到116株真菌,其中子囊菌门(Ascomycota)101株,担子菌门(Basidiomycota)14株,毛霉菌门(Mucoromycota)1株;优势菌属为枝孢霉属(Cladosporium)、茎点霉属(Phoma)和Vishniacozyma,分别占水体总分离菌株的9.48%、6.90%、6.90%。沉积物中共分离得到132株真菌,其中子囊菌门115株,担子菌门14株,毛霉菌门3株;优势属为青霉属(Penicillium)、木霉属(Trichoderma)和小球腔霉属(Leptosphaeria),分别占沉积物总分离菌株的13.04%、10.43%和8.70%。

2.3 不同河流水生真菌群落组成差异

2.3.1 不同河流水生真菌多样性分析 α多样性指数指示了伊犁河流域三支一干河流中水生真菌的物种多样性(表2)。Shannon指数(H′)分析可知,喀什河样本中真菌群落多样性最大,为3.79;巩乃斯河样本中真菌群落多样性最小,为3.21;Simpson指数显示各样本间差异不大,喀什河样本中水生真菌类群优势度最大,为0.976;巩乃斯河样本优势度最小,为0.950;Magalef丰富度和Pielou均匀度指数表明在巩乃斯河水环境真菌群落分布最不均匀,丰富度最低,指数分别为0.95和7.86;特克斯河水环境真菌群落分布最均匀,指数为1.00。上述结果表明,伊犁河流域不同河流间可培养水生真菌的菌落组成、丰度及多样性不同。

表2 不同河流可培养水生真菌菌群的多样性Table 2 Diversity of culturable aquatic fungal flora in different rivers

2.3.2 不同河流水生真菌菌属的差异在伊犁河流域内,特克斯河和喀什河分离出的菌株最多,均为73株,占总分离菌株的29.44%;巩乃斯河分离的菌株最少(44株),占菌株总数的17.74%。对比伊犁河流域4条河流中真菌菌属的分布特征,发现喀什河分离的菌株有46个属,在4条河中所占比重最多;其次是特克斯河,分离的菌株有43个属;伊犁河干流分离的菌株有27个属;巩乃斯河分离的菌株有23个属(图2)。在属的水平上,枝孢酶属(Cladosporium)、青霉属(Penicillium)和镰刀菌属(Fusarium)在4条河中都有分布;木霉属(Trichoderma)除喀什河外均有分布;小球腔霉属(Leptosphaeria)只在特克斯河和喀什河分布;Vishniacozyma只在巩乃斯河和喀什河中分布;巩乃斯河中无链格孢属(Alternaria)、背芽突霉属(Cadophora)、茎点霉属(Phoma)和Solicoccozyma分布;曲霉属(Aspergillus)除特克斯河外均有分布;Parasarocladium只分布在伊犁河干流。综上所述,不同河流水生真菌群落组成与分布存在较明显差异。

图2 总丰度前1%属水平上的真菌多样性Fig.2 Fungal diversity at the genus level in the top 1% of total abundance

2.4 伊犁河流域真菌胞外酶活性的筛选

本研究对分离获得的248株真菌进行了9种胞外酶活性筛选,部分菌株酶活性检测结果见图3。

图3 部分菌株酶活性检测结果Fig.3 Results of enzyme activity detection of some strains

根据筛选结果可知,产1种及1种以上胞外酶的菌株共有153株,其中子囊菌门(Ascomycota)真菌136株,担子菌门(Basidiomycota)真菌17株,共62个属;产2种及2种以上胞外酶的菌株共有100株,其中子囊菌门真菌88株,担子菌门真菌12株,共47个属,部分菌株酶活性测定结果见表3。在88株子囊菌真菌(41个属)中,有7株菌株产5种及5种以上胞外酶,有43株菌株至少产3种胞外酶,优势菌属为青霉属(Penicillium)、枝孢霉属(Cladosporium)和小球腔霉属(Leptosphaeria)。在12株担子菌真菌(6个属)中,有1株菌株产5种及5种以上胞外酶,有4株菌株产3种及3种以上胞外酶,优势属为Vishniacozyma。

表3 部分可培养真菌产胞外酶活性测定结果Table 3 Measurement results of extracellular enzymes produced by some culturable fungi

产胞外酶活性菌株的比较结果(表3)显示,产胞外纤维素酶的菌株(71株)最多,其次是产淀粉酶(53株)和酯酶(54株)的菌株,随后是产木聚糖酶的菌株(44株),产明胶酶、木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、漆酶和偶氮还原酶活性的菌株较少。产纤维素酶优势属为枝孢霉属(Cladosporium);产淀粉酶和木聚糖酶的主要菌属为青霉属(Penicillium)。由表4可知,淀粉酶、酯酶、纤维素酶、木聚糖酶、明胶酶和木质素过氧化物酶这6种酶类中沉积物产胞外酶的菌株数均高于水体,淀粉酶和酯酶沉积物产胞外酶的菌株数为水体的2倍,锰过氧化物酶、漆酶和偶氮还原酶水体产胞外酶的菌株数高于沉积物。

表4 伊犁河流域产胞外酶菌株分布Table 4 Distribution of extracellular enzyme-producing strains in the Ili River basin

在空间分布上,9种胞外酶菌株在4条河流中均有分布,其中:特克斯河40株(25个属)、巩乃斯河25株(18个属)、喀什河43株(31个属)、伊犁河干流45株(25个属)包含1种及1种以上胞外酶活性,分别占相应河流分离菌株的54.79%、56.82%、58.90%和77.59%;产2种及2种以上胞外酶活性的真菌中,特克斯河27株(18个属)、巩乃斯河16株(14个属)、喀什河30株(22个属)、伊犁河干流27株(16个属),分别占相应河流分离菌株的36.40%、36.36%、41.10%和46.56%。特克斯河真菌产酶优势属为枝孢霉属(Cladosporium)和小球腔霉属(Leptosphaeria);巩乃斯河真菌产酶优势属为曲霉属(Aspergillus)和Vishniacozyma;喀什河真菌产酶优势属为小球腔霉属和青霉属(Penicillium);伊犁河干流真菌产酶优势属为青霉属和枝孢霉属。

3 讨论

3.1 伊犁河流域真菌多样性差异

本研究从伊犁河流域共获得248株可培养真菌,水体116株,沉积物132株,对其进行序列对比及系统发育分析发现,248株真菌归属于3个门、87个属、115个种。其中,子囊菌门(Ascomycota)为主要优势菌群。伊犁河流域可培养真菌类群多样性明显高于滇池水体和沉积物[26](61个属)、黑龙江乌伊岭湿地自然保护区水体[27](16个属)和程海湖水体和沉积物[28](50个属),水生真菌优势属与上述水环境相同,均为青霉属(Penicillium)、枝孢霉属(Cladosporium)和木霉属(Trichoderma)。

伊犁河流域主要干支流水体和沉积物的可培养真菌分布具有明显差异,优势菌群也不同,沉积物中真菌的类群较多(53个属),水体中的真菌类群较少(34个属);沉积物和水体的优势属也不同,沉积物的优势属为青霉属,占沉积物菌株总数的11.36%;而水体的优势属为枝孢霉属,占水体菌株总数的8.62%;沉积物和水体中真菌共有属为22个,占伊犁河流域真菌分布属的25.29%;两种介质中独有真菌属为43个(水体12个属,沉积物31个属),占伊犁河流域真菌分布属的49.43%。伊犁河流域水体和沉积物中水生真菌类群多且多样性丰富,沉积物中分离得到的可培养真菌无论是种群和数量都比水体的多,该结果与彭柯等[29]对北运河水体及沉积物微生物群落组成的对比研究相符,从沉积物中分离得到的真菌种类和数量要明显高于水体,沉积物中营养组分和有机质较水体丰富,更适合真菌菌株的生存和繁衍[30]。

α多样性指数分析表明,伊犁河流域除巩乃斯河外,特克斯河和喀什河可培养真菌群落的Simpson、Shannon和Magalef指数均高于伊犁河干流。Xue等[31]对乌鲁木齐河的真菌多样性进行研究,发现上游真菌群落多样性高于下游,上游样品的Shannon指数最高,Magalef指数有所不同,并指出大量的人类活动对真菌的群落结构有很大的影响。Sudheep等[32]和Pietryczuk等[33]对河流的真菌多样性进行研究,表明河流上中游真菌群落的α多样性指数最高。总的来说,伊犁河流域与上述这些河流真菌的群落多样性指数变化相似,在人类活动较多的地区,α多样性指数相对较低。但伊犁河流域各河流间的α多样性指数变化较小,体现了各河流之间真菌群落结构既有差异性又有相似性。伊犁河流域面积广阔,从3个主源头到干流区的地理差异性和人类活动特征显著不同,这也是造成各河流环境中水生真菌多样性指数不同的主要原因。

3.2 伊犁河流域真菌的胞外酶活性

对伊犁河流域分离的可培养真菌进行9种胞外酶活性菌株的筛选,发现产1种及1种以上胞外酶的菌株共有153株,占总分离菌株的61.69%;共有100株菌株至少产2种胞外酶,占总分离菌株的40.32%。伊犁河流域可培养真菌产胞外酶的优势属为枝孢霉属(Cladosporium)、青霉属(Penicillium)和曲霉属(Aspergillus),与晋方佑[28]对程海湖及郭潇等[34]对湖光岩的相关研究一致。其中,产胞外纤维素酶的菌株(71株)最多,优势属为青霉属;其次是产淀粉酶(53株)和酯酶(54株)的菌株,产淀粉酶的优势属为青霉属,产纤维素酶与淀粉酶的优势属与戈帆[26]对滇池水体和沉积物中真菌胞外酶活性的研究结果相同;产酯酶的优势属为曲霉属。研究结果表明,伊犁河流域可培养真菌产胞外酶菌株多样性较丰富;说明在营养较为贫瘠的条件下,真菌产生拮抗活性物质作为中间竞争的方式,以此占据有利的水生生态环境[35]。

从特克斯河至伊犁河干流,可培养真菌产胞外酶活性的类群均以子囊菌门(Ascomycota)为主,真菌菌株产胞外酶活性的比例逐渐增加(54.79%～77.59%),伊犁河干流菌株产胞外酶活性的比例最高(77.59%)。表明伊犁河流域可培养真菌产胞外酶活性菌株的空间分布差异性较显著。4条河流中产胞外酶的真菌种群既有共性也有其特异性,其原因可能是这4条河流具有地理相似性,而产酶种群可能与自身所存在的河流环境的差异性有关。戈帆[26]通过对滇池真菌胞外酶活性与环境因子间相关性研究发现,滇池各个区域之间的真菌胞外酶活性与环境因子(总氮、总磷、氢离子浓度指数、温度、电导率等)具有极显著相关性,谭金连[36]和李贺鹏[37]对沉积物中真菌胞外酶活性与理化因子间的关系进行分析,也表明真菌胞外酶活性与环境因子(总氮、总磷、总有机碳、温度、电导率等)相关性显著。因此,推测伊犁河流域水生真菌的胞外酶活性可能会随河道周边地理、气候条件和人类活动等外界环境因子的改变而变化。