基于质量源于设计理念优化都梁方渗漉提取工艺

李燕燕，周玮玲，侯寓森，赵淋仙，徐纯艺，马 川，刘 兵，代文东，何 瑶*，胡慧玲*

1. 西南特色中药资源国家重点实验室，成都中医药大学药学院，四川 成都 611137

2. 四川全泰堂中药饮片有限公司，四川 遂宁 629000

都梁方源于宋代王璆集民间验方所著《是斋百一选方》[1]，由白芷研末加炼蜜为丸而成。后人在此基础上加入川芎作为臣药，以4∶1 的质量配比制成蜜丸剂（《北京市中药成方选集》），能散风止痛，主治感冒风寒、头痛眩晕、鼻塞不通、身热倦怠[2]。方中白芷与川芎配伍，白芷善入头部，祛风散寒、通窍止痛，多用于眉棱骨痛，治阳明经头痛，为君药；川芎乃血中之气药，能上行头目，下行血海，活血行气，为臣药。二药合用，共奏祛风散寒、活血止痛之效，临床上用于风寒瘀血阻滞脉络所致的头痛，症见头胀痛或刺痛，痛有定处，反复发作，遇风寒诱发或加重。研究表明，都梁方中白芷、川芎配伍在镇痛、抗炎等方面具有良好的协同作用[3-4]，醇提部位是其发挥药效的重要部位，其药效物质基础包括白芷香豆素类成分、川芎苯酞类及有机酸类成分等[5-7]。都梁方作为经典头痛验方，研究人员对其进行了不同的剂型改良研究，如都梁口服液[8]、都梁颗粒[9]等。《中国药典》2020 年版收录有都梁丸、都梁软胶囊及都梁滴丸[10]。然而，现有的都梁方制剂提取工艺优化往往以方中1 个或2 个成分为指标，且溶剂用量、乙醇体积分数、提取温度等参数范围选择不一[11-12]。都梁软胶囊和都梁滴丸的提取工艺均采用了乙醇为提取溶媒，但乙醇的体积分数不一，工艺参数不明确，且《中国药典》2020 年版质量标准中仅规定白芷欧前胡素和异欧前胡素为含量测定指标成分，未对川芎有效成分做定量质量检测要求，其质量控制和工艺研究有待加强。

中药质量是保证中药功效稳定性及应用安全性的基础，其规范化、标准化、现代化，是推动中药走向国际化的重要前提[13]。近年来国家高度重视中药全过程质量控制体系的建设，《国务院办公厅关于全面加强药品监管能力建设的实施意见》《国家药监局关于促进中药传承创新发展的实施意见》等均明确提出要加强中药全过程质量控制，促进中药传承创新发展。质量源于设计（quality by design，QbD）是一种用于药品研发生产的科学理念，注重于对源头、过程的控制，将药品质量控制从成品检验移至前期工艺设计、生产过程当中，从设计层次保证药品质量。QbD 的核心在于建立设计空间，其本质在于获得一个参数操作和原料质量波动的优化范围，各因素在可接受的范围内变动，均不会影响工艺所得产物的质量稳定性。在中药制剂工艺环节中，提取工艺是中药复方药效物质与质量控制领域的核心环节，优化中药复方提取工艺参数，是高效充分提取药效物质，保障临床有效性的前提，也是影响中药制剂质量的关键因素[14]。因而，本实验在QbD 理念下明确关键工艺参数（critical process parameters，CPPs）和关键质量属性（critical quality attributes，CQAs），以白芷中欧前胡素、异欧前胡素、佛手柑内酯和川芎中阿魏酸、Z-藁本内酯、洋川芎内酯A为指标成分，采用Box-Behnken 实验优化渗漉提取工艺，建立设计空间并进行验证，以保证都梁方渗漉提取工艺的稳定，为促进都梁方制剂质量控制水平提升及其改良型新药开发奠定基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Thermo Ultimate 3000 型高效液相色谱仪，8321033DAD 型检测器，7120988 型四元泵，8738269型自动进样器，6280773 型柱温箱，美国Thermo Fisher 公司；PS-100A 型超声清洗机，深圳洁康超声波清洗器有限公司；SQP 型十万分之一电子天平，赛多利斯科学仪器有限公司；UPK-I-10T 型优普系列超纯水器，四川优普超纯科技有限公司；800A 型佰好佳多功能粉碎机，永康市红太阳机电有限公司；DZKW-4 型电子恒温水浴锅，北京中兴伟业仪器有限公司；101-2B 型电热恒温干燥箱，尚诚仪器制造有限责任公司。

1.2 试药

白芷饮片（批号21110103）购自四川翼方中药饮片有限公司，执行《中国药典》2020 年版标准；酒川芎饮片（批号210701）购自四川德仁堂中药科技股份有限公司，执行《四川省中药饮片炮制规范》2015 年版标准。经成都中医药大学中药鉴定专业刘薇副教授鉴定，白芷为伞形科当归属植物杭白芷Angelicadahurica(Fisch. ex Hoffm.) Benth. et Hook.f. var.formosana(Boiss.) Shan et Yuan 的干燥根，川芎为伞形科藁本属植物川芎LigusticumchuanxiongHort.的干燥根茎。

对照品欧前胡素（批号21070702）、异欧前胡素（批号21091802）、佛手柑内酯（批号21031001）、阿魏酸（批号 22032207）、Z-藁本内酯（批号wkq20051709）、洋川芎内酯A（批号22021701），质量分数均≥98%，购自成都普菲德对照品科技有限公司。色谱纯冰乙酸（批号2021092701）、分析纯乙醇（批号2022091501）购自成都市科隆化学品有限公司；色谱纯甲醇（批号WXBD8013V）购自西格玛奥德里奇贸易有限公司。

2 方法与结果

2.1 都梁方的提取工艺

称取白芷粗粉40.0 g，川芎粗粉10.0 g，采用渗漉法提取。加适量一定体积分数的乙醇，浸渍一定时间后，以适宜的速度渗漉，收集渗漉液，调整体积至500 mL（饮片量0.1 g/mL）。

2.2 CPPs 和CQAs 的确定

2.2.1 CPPs 的的筛选及风险评估 都梁方采用渗漉法提取过程中主要受4 个方面的因素影响：环境、设备、饮片和提取条件，将以上4 个因素细化，绘制成鱼骨图，初步确定潜在关键工艺参数（potential critical process parameters，pCPPs），结果见图1。采用失效模式及效应分析（failure modes and effect analysis，FMEA），根据鱼骨图提供的pCPPs 进行筛选，通过严重程度（S）、发生概率（O）和检测难易程度（D）对工艺参数的风险进行量化，评分细则见表1。结合文献调研和前期研究基础，对各工艺参数的S、O及D赋值并计算风险优先系数（risk priority number，RPN），RPN＝S×O×D。根据RPN 值高低确定CPPs，每个参数的RPN 值见表2，当RPN 值大于10 时，认定其为都梁方渗漉提取过程中的高风险因素，将被识别为CPPs。由FMEA风险评估结果可知，乙醇体积分数、乙醇用量、渗漉体积流量、浸渍时间的RNP 值较大，因此，选定乙醇体积分数、乙醇用量、渗漉体积流量、浸渍时间为影响都梁方渗漉提取工艺的CPPs。

图1 都梁方提取工艺参数风险辨识鱼骨图Fig. 1 Fishbone diagram for risk identification of Duliang formula extraction process parameters

表1 都梁方渗漉提取工艺S、O 及D 的评分原则Table 1 Scoring principles of S, O and D in percolation extraction process of Duliang formula

表2 都梁方渗漉提取工艺FMEA 风险评估结果Table 2 FMEA risk assessment results of percolation extraction process in Duliang formula

2.2.2 CQAs 的确定 根据刘昌孝院士[15]提出的质量标志物（quality markers，Q-Marker）概念，基于有效性、特有性、质量传递与溯源、可测性和复方配伍的“五原则”，通过文献研究预测欧前胡素、异欧前胡素、佛手柑内酯、阿魏酸、Z-藁本内酯、洋川芎内酯A 为都梁方的质量标志物[4,16-20]。同时，考虑中药提取物的干膏率，最终将6 个成分的提取量（Y1～Y6）和干膏率作为都梁方提取工艺的CQAs。

2.3 都梁方中6 个CQAs 成分含量测定方法的建立

2.3.1 混合对照品溶液的制备 分别精密称取对照品欧前胡素、异欧前胡素、佛手柑内酯、阿魏酸、Z-藁本内酯、洋川芎内酯A 对照品2.92、1.08、0.46、0.82、7.93、9.20 mg，加入甲醇定容到10 mL，溶解制成质量浓度分别为292、108、46、82、793、920 μg/mL 的混合对照品储备溶液，混匀备用。

2.3.2 供试品溶液的制备 称取白芷粗粉40.0 g、川芎粗粉10.0 g，加入一定量一定体积分数的乙醇溶液，以适宜的渗漉速度提取，收集渗漉液，调整体积至500 mL（饮片量0.1 g/mL），混匀，0.22 μm滤膜滤过，即得。

2.3.3 阴性供试品溶液的制备 分别称取缺白芷、川芎的粗粉，按照“2.3.2”项下方法制备缺白芷和缺川芎阴性供试品溶液。

2.3.4 色谱条件 色谱柱为Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；流动相为甲醇-1%醋酸水溶液，梯度洗脱：0～8 min，35%～75%甲醇；8～23 min，75%甲醇；检测波长为300 nm；柱温为30 ℃；进样量10 μL；体积流量1 mL/min。

2.3.5 专属性试验 精密移取“2.3.1”项下混合对照品溶液、“2.3.2”项下供试品溶液、“2.3.3”项下阴性供试品溶液各10 μL，按“2.3.4”项下色谱条件进样测定。结果表明，供试品溶液中欧前胡素、异欧前胡素、佛手柑内酯、阿魏酸、Z-藁本内酯、洋川芎内酯A分别与对照品色谱峰的保留时间对应一致，各色谱峰均能较好分离（R＞1.5），阴性对照无明显干扰，色谱图见图2。

图2 6 种成分的混合对照品溶液 (A)、都梁方供试品溶液 (B)、缺白芷阴性样品 (C)、缺川芎阴性样品 (D) 的HPLC 图Fig. 2 HPLC diagrams of six components mixed reference solution (A), Duliang formula sample solution (B), negative sample without Angelicae Dahuricae Radix (C) and negative sample without Chuanxiong Rhizoma (D)

2.3.6 线性关系考察 取“2.3.1”项下混合对照品储备溶液，用甲醇制得系列质量浓度的混合对照品溶液，按“2.3.4”项下色谱条件分别测定不同质量浓度下欧前胡素、异欧前胡素、佛手柑内酯、阿魏酸、Z-藁本内酯、洋川芎内酯A 的色谱峰峰面积，以对照品溶液质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），分别对欧前胡素、异欧前胡素、佛手柑内酯、阿魏酸、Z-藁本内酯、洋川芎内酯A 质量浓度进行线性回归，得到回归方程分别为欧前胡素Y＝453.58X－0.761 8，R2＝0.999 8；异欧前胡素Y＝458.36X－0.084 1，R2＝0.999 8；佛手柑内酯Y＝539.26X－0.049 1，R2＝0.999 8；阿魏酸Y＝728.41X－0.453 9，R2＝0.999 9；Z-藁本内酯Y＝200.75X＋0.082 1，R2＝0.999 7；洋川芎内酯AY＝64.306X－0.764 3，R2＝0.999 5。结果表明，欧前胡素在18.250～292.000 μg/mL，异欧前胡素在6.750～108.000 μg/mL，佛手柑内酯在 2.875 ～46.000 μg/mL，阿魏酸在5.125～82.000 μg/mL，Z-藁本内酯在49.612～793.800 μg/mL，洋川芎内酯A 在57.500～920.000 μg/mL 与峰面积线性关系良好。

2.3.7 精密度试验 取“2.3.2”项下供试品溶液1份，按“2.3.4”项下色谱条件连续进样6 次，分别计算欧前胡素、异欧前胡素、佛手柑内酯、阿魏酸、Z-藁本内酯、洋川芎内酯A 的峰面积RSD 值为0.64%、0.74%、0.69%、0.48%、0.65%、0.63%，结果表明仪器精密度良好。

2.3.8 稳定性试验 取“2.3.2”项下供试品溶液1份，按“2.3.4”项下色谱条件分别在制备后0、2、4、8、12、24 h 进样测定，分别计算欧前胡素、异欧前胡素、佛手柑内酯、阿魏酸、Z-藁本内酯、洋川芎内酯A 的峰面积RSD 值为1.06%、0.95%、1.11%、0.96%、1.09%、1.23%，结果表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.3.9 重复性试验 依据“2.3.2”项下方法平行制备6 份供试品溶液，按“2.3.4”项下色谱条件进行测定，分别计算欧前胡素、异欧前胡素、佛手柑内酯、阿魏酸、Z-藁本内酯、洋川芎内酯A 质量分数的RSD 值为1.29%、1.60%、1.42%、1.59%、1.18%、1.17%，结果表明方法重复性良好。

2.3.10 加样回收率试验 依据“2.3.2”项下方法平行制备6 份供试品溶液，分别加入与供试品溶液中相应成分含量约1∶1 的对照品溶液，按“2.3.4”项下色谱条件进行测定，计算得到供试品溶液中欧前胡素、异欧前胡素、佛手柑内酯、阿魏酸、Z-藁本内酯、洋川芎内酯A 的平均加样回收率分别为102.09%、102.69%、101.20%、107.67%、105.69%、104.13%，RSD 分别为3.48%、4.06%、1.49%、1.79%、1.18%、1.60%，符合试验要求。

2.3.11 样品测定 按照“2.3.2”项方法制备供试品溶液，按照“2.3.4”项色谱条件进行测定，计算各指标成分的含量（各指标成分质量/总投药量）。

2.4 干膏率的测定

按干燥失重法进行测定，精密量取都梁方渗漉液25 mL 于已恒定质量的蒸发皿中，水浴蒸干，于105 ℃电热鼓风干燥箱中干燥3 h，置干燥器中冷却30 min，迅速称定质量，再于105 ℃干燥1 h，冷却称定质量，反复干燥至恒定质量（即±0.3 mg），计算干膏得率。

m为25 mL 提取液中干浸膏质量，V为提取液总体积，M为总投药量

2.5 CPPs 与CQAs 的相关性研究

2.5.1 Box-Behnken 实验设计与结果 为探讨都梁方醇提工艺中CPPs［乙醇体积分数（A）、乙醇用量（B）、渗漉体积流量（C）、浸渍时间（D）］与CQAs［欧前胡素（Y1）、异欧前胡素（Y2）、佛手柑内酯（Y3）、阿魏酸（Y4）、Z-藁本内酯（Y5）、洋川芎内酯A（Y6）含量和干膏率］的相关性，设计4 因素3 水平的Box-Behnken 实验，Box-Behnken 实验设计与响应值见表3。

表3 都梁方渗漉提取工艺Box-Behnken 响应面实验设计及结果Table 3 Box-Behnken response surface experimental design and results of Duliang formula percolation extraction process

2.5.2 综合评价指标权重的确立

（1）层次分析（analytic hierarchy process，AHP）法：AHP 是主观确定权重的方法[21]。现代研究表明，欧前胡素、异欧前胡素是君药白芷中重要的香豆素类成分，具有镇痛作用，是其关键药效物质；阿魏酸、Z-藁本内酯是臣药川芎发挥活血止痛的关键药效成分。故根据都梁方药味君臣配伍、各成分药效作用的重要性以及各成分含量的多少，将这6 种指标成分及干膏率作为权重指标予以量化，即将7 项指标分成7 个层次，并确定各指标的优先顺序：欧前胡素＝异欧前胡素＞佛手柑内酯＞阿魏酸＝Z-藁本内酯＞洋川芎内酯A＝干膏率，以此构成成对比较的判断优先矩阵，并获得各项指标的相对评分，指标成对比较的判断优先矩阵见表4。根据表4 评分结果，AHP 法计算得到欧前胡素、异欧前胡素、佛手柑内酯、阿魏酸、Z-藁本内酯、洋川芎内酯A含量及干膏率7 项指标权重系数分别为0.304 5、0.304 5、0.152 2、0.076 1、0.076 1、0.052 8、0.038 1，一致性比例因子（CR＝CI/RI，其中，CR 为随机一致性比率，CI 为一致性指标，RI 为平均随机一致性指标）＝0.037/1.36＝0.027＜0.10，即指标成对比较判断矩阵具有满意的一致性，权重系数有效[22]。

表4 AHP 法指标成对比较的判断优先矩阵Table 4 Judgment priority matrix of AHP index comparison in pairs

（2）基于指标相关性的权重确定方法（criteria importance through intercriteria correlation，CRITIC）法：中药复方在提取过程中配伍的变化及成分间的相互作用致使各指标性成分对复方总体提取效果的贡献不同，主观确定其权重系数有失偏颇。CRITIC法是一种以评价指标间的对比强度及冲突性作为基础综合衡量的客观赋权分析法，对比强度以标准差的形式来表现，即标准差的大小表明在同一指标内，各方法取值差距的大小；而各指标间的冲突性是以指标之间的相关性为基础。故CRITIC 法既考虑了指标变异大小对权重的影响，又考虑了各指标间的冲突性。采用CRITIC 法计算各指标权重系数，首先需要对数据进行标准化处理，即评价指标值＝(实测值－最小值)/(最大值－最小值)×100，用SPSS 在线统计软件处理无量纲化数据，计算得到欧前胡素、异欧前胡素、佛手柑内酯、阿魏酸、Z-藁本内酯、洋川芎内酯A 含量及干膏率7 项指标权重系数分别为0.127 8、0.212 9、0.090 0、0.130 6、0.213 5、0.097 4、0.127 9。

（3）AHP-CRITIC 混合加权法：根据都梁方功能主治及君臣佐使的分析，AHP 法量化了评价指标两两间比较判断的优先信息，得到了以主观信息为基础的权重系数（ωAHP），基本体现了都梁方各指标的主次顺序及君臣佐使的顺序；同时采用CRITIC法求得相应指标的客观权重系数（ωCRITIC），这不仅考虑到了各样本数据的变异性及指标间的相关性对赋权的影响，而且避免了主观赋权存在的偏颇。但评价权重既要注重客观又要不失主观，故而将二者结合起来，计算综合权重系数（ω复合），即ω复合ij＝ωAHPijωCRITICij/∑ωAHPijωCRITICij，以期评价结果更加客观、真实[23]。通过计算得欧前胡素、异欧前胡素、佛手柑内酯、阿魏酸、Z-藁本内酯、洋川芎内酯A含量及干膏率7 项指标的综合权重系数分别为0.254 2、0.423 4、0.089 5、0.064 9、0.106 1、0.033 6、0.028 2。

（4）综合评价结果的比较：分别采用经AHP法、CRITIC 法及AHP-CRITIC 混合加权法分析得到的权重系数对实验结果进行综合评分比较，结果见表5。通过相关系数分析，AHP 法与CRITIC 法之间的相关系数为0.933，AHP 法与AHP-CRITIC混合加权法的相关系数为0.997，CRITIC 法与AHPCRITIC 混合加权法之间的相关系数为0.921，三者相关性显著（P＜0.05），说明3 种权重法得到的评分结果具有一致性。从权重系数分析，CRITIC 法与AHP 法的相关系数为0.289，相关性不显著（P＝0.529＞0.05），说明二者所反映信息不具有叠加性。相比之下，AHP-CRITIC 混合加权法是从主观和客观2 个方面加以考虑，所体现的信息量也就更为全面[24]，所得综合评分结果更为科学、合理、更接近实际情况，因此本研究采用AHP-CRITIC 法计算综合评分。

表5 AHP、CRITIC、AHP-CRITIC 3 种赋权法的综合评分结果Table 5 Comprehensive scoring results of AHP, CRITIC and AHP-CRITIC three weighting methods

2.5.3 CQAs 的回归模型及方差分析结果 利用Design-Expert.V8.0.6 软件对AHP-CRITIC 综合评分结果进行2 次多元回归拟合，得到4 个自变量的2次多元回归模型，其回归方程：综合评分＝89.31＋6.93 A＋4.37 B－0.67 C－1.64 D－0.79 AB＋0.45 AC＋0.47 AD－0.75 BC－0.07 BD＋3.15 CD－7.89 A2－2.75 B2＋0.88 C2＋1.43 D2，回归模型方差分析结果见表6。

表6 Box-Behnken 响应面实验的方差分析结果Table 6 Analysis of variance results of Box-Behnken response surface experiment

根据方差分析结果，2 次多元模型极显著（P＜0.000 1），失拟项不显著（P＝0.103 9＞0.05），说明该模型具有统计学意义，可用于表示各因素与响应值之间的关系。方程的拟合相关系数R2＝0.933 8，Radj2＝0.867 7，变异系数（CV）＝3.10%，表明模型拟合效果良好，因此，可用此模型进行预测和分析。提取工艺考察的4 个因素中，乙醇体积分数A（P＜0.000 1）和乙醇用量B（P＜0.000 1）为极显著项，渗漉体积流量C（P＝0.399 8）以及浸渍时间D（P＝0.051 5）为不显著项；二次项中，A2（P＜0.000 1）和B2（P＝0.019 7）为显著项，C2（P＝0.412 6）和D2（P＝0.193 0）为不显著项，表明所选因素与响应值并非简单的线性关系；交互项CD（P＝0.033 2）显著，其交互作用不明显。根据各因素F值大小，各因素对综合评分的影响为A＞B＞D＞C。

通过软件绘制各因素对都梁方渗漉提取工艺综合评分影响的3D 响应面图，如图3 所示。乙醇体积分数（A）、乙醇用量（B）对都梁方渗漉提取工艺综合评分影响较大，形成的3D 响应面曲线图较陡峭。从图的颜色变化可以初步判定，变化趋势增加，其颜色也呈加深趋势，颜色越接近红色表明综合评分越高。运用Design-Expert.V8.0.6 软件优化所得的都梁方渗漉提取最佳工艺的预测值为乙醇体积分数51.48%，乙醇用量7.98 倍，渗漉体积流量为3.00 mL/min、浸渍时间为12.02 h，在此条件下欧前胡素为1.577 2 mg/g，异欧前胡素为0.568 9 mg/g，佛手柑内酯为0.144 2 mg/g，阿魏酸为0.377 1 mg/g，Z-藁本内酯为3.244 4 mg/g，洋川芎内酯A 3.081 9 mg/g，干膏率为20.190 6%，综合评分为97.728 9分。结合实际，响应面实验中所得提取工艺参数最优值为乙醇体积分数52%，乙醇用量8 倍，渗漉体积流量为3 mL/min、浸渍时间为12 h。

图3 4 因素对综合评分的响应面图Fig. 3 Response surface of four factors to comprehensive score

2.6 设计空间的建立

由于工业生产中最佳提取条件具有一定的局限性，故根据Box-Behnken 实验所得结果，设定综合评分≥88 分为优化目标，建立设计空间，为工业生产确定提取条件范围，以满足生产的实际需要。由于根据模型建立的设计空间是一个动态的设计空间，乙醇体积分数、乙醇用量、渗漉体积流量、浸渍时间都是调节设计空间的因素，任一因素的改变都会造成设计空间范围的波动。故有必要协调4 个因素之间的关系以获得较好的实验结果。但是平面设计空间仅能体现2 个因素，故选择渗漉体积流量、浸渍时间为固定因素，构建影响显著的乙醇体积分数、溶剂用量的设计空间。

结合实际，分别选择满足优化目标的渗漉体积流量4、3 mL/min 和浸渍时间12、24 h 为固定水平，建立都梁方提取工艺参数的设计空间。由于模型的预测值与真实值存在一定差异，使设计空间的边界具有不确定性，因此在定义设计空间参数时加入置信水平α＝0.05 的置信区间，对设计空间进行优化，通过Overlay plot 展示，黄色部分即为设计空间，结果见图4。实际生产过程中，考虑到对渗漉液质量进行控制的难易程度以及适用于工业化大生产，因此最终确定操作空间为乙醇体积分数50%～55%、乙醇用量为8～10 倍、渗漉体积流量为3～4 mL/min、浸渍时间为12～24 h。

图4 都梁方提取工艺设计空间图Fig. 4 Space diagram of extraction process design of Duliang formula

2.7 控制空间的验证

为了验证所建立模型的有效性以及设计空间的可靠性，随机选取设计空间4 个点进行验证，其中1～2 号在空间内，3 号在置信区间，4 号在空间外，实验条件的选取见表7，验证结果见表8。结果显示，实际值与预测值之间的偏差均小于5%，可见模型具有良好的预测能力；设计空间及置信区间内实验点综合评分均达到要求，而设计空间外的点均不达要求，表明在设计空间内操作能保证提取工艺的稳定可靠。

表7 设计空间验证试验点的选取Table 7 Selection of verification test sites in design space

表8 设计空间验证试验结果Table 8 Results of space verification test

3 讨论

3.1 提取方法的选择与确定

国家药品监督管理局药品审评中心发布的《中药复方制剂生产工艺研究指导原则（试行）》[25]中，明确指出中药复方制剂生产工艺研究应基于“质量源于设计”的理念以及体现复方整体质量特性。目前，QbD 理念在中药提取工艺优化[26]、中药制备及制剂优化[27-28]、中药分离纯化[29]中研究较多，旨在提高工艺稳健性和产品质量可控性，故本研究采用QbD 理念优化都梁方提取工艺。都梁方由白芷、川芎2 味组成，其中白芷主要药效成分为香豆素、挥发油等[30]，川芎主要药效成分为挥发油、有机酸、生物碱等[18]。白芷香豆素虽可溶于沸水，但其中欧前胡素和异欧前胡素受热不稳定，前者易发生Claisen 烯丙基重排，生成别欧前胡素，即使在真空中加热也会如此[31]，故长时间较高温度的提取不利于香豆素类成分的提取。渗漉法是一种动态浸出方法，提取率高，一般在常温下进行，尤为适用于热不稳定成分的提取，在中药生产中应用广泛。有学者认为借鉴QbD 理念对渗漉工艺进行优化，是今后的发展趋势[32]。因此，本研究采用乙醇渗漉法提取都梁方，能较好地保留其有效成分，充分发挥其临床疗效。

关于乙醇体积分数的选择，前期单因素实验发现6 个指标成分含量均在50%乙醇处出现极大值。在30%～90%乙醇时，阿魏酸提取量在50%乙醇处取得最优水平，而后随着乙醇体积分数的升高其含量逐渐降低；欧前胡素、异欧前胡素、佛手柑内酯、Z-藁本内酯、洋川芎内酯A 这5 个成分含量随着乙醇体积分数的变化趋势整体一致，在30%～50%乙醇时均随着乙醇体积分数的升高而升高，在50%乙醇处取得较优水平，而后随着乙醇体积分数的升高其含量先降低后升高，在90%乙醇处的含量非常接近于50%乙醇水平。可能是以50%乙醇为提取溶媒时，提取液中成分丰富、各成分间产生“助溶”现象。故本研究以50%乙醇为0 水平进行响应面优化。

3.2 CQAs 的选择及综合评价指标的赋权

本研究基于刘昌孝院士提出的中药质量标志物（Q-Marker）的有效性、特有性、质量传递与溯源、可测性和复方配伍“五原则”，进行CQAs 的筛选。“有效”是Q-Marker 的核心要素。研究表明，香豆素类成分是治疗偏头痛的药效物质基础[16-17]，欧前胡素、异欧前胡素、佛手柑内酯为君药白芷中香豆素类成分，具有镇痛抗炎的作用，能明显降低偏头痛模型大鼠血和脑中一氧化氮水平。Z-藁本内酯、洋川芎内酯A 为臣药川芎中苯酚类成分，具有扩血管、镇痛等药理作用[18]。阿魏酸也来源于臣药川芎，具有抗凝血、抗炎镇痛等作用[19]。

从质量传递与溯源的角度，血中的效应成分是质量传递体系的最终环节，也是中药Q-Marker 确定的重要依据。有研究对都梁丸的入血成分进行分析研究[20]，通过对照品鉴别出欧前胡素、异欧前胡素、佛手柑内酯、阿魏酸、藁本内酯、洋川芎内酯A 等原型入血成分，表明这6 个成分都可入血，可作为都梁方质量控制的重要参考。复方配伍方面，有研究发现川芎作为臣药可以促进君药白芷中香豆素类化合物欧前胡素、异欧前胡素、佛手柑内酯等的吸收，同时减缓其在体内的消除速率，提高其生物利用度[4]。最后，这6 个成分均具有可测性。因而选择这6 个成分作为Q-Marker 进行含量控制。

在加权评分方面，欧前胡素、异欧前胡素为都梁滴丸和都梁软胶囊在《中国药典》2020 年版的含量测定指标成分，且都梁方渗漉液中佛手柑内酯含量低于欧前胡素、异欧前胡素，故AHP 法赋权时君药白芷中3 个指标成分的优先顺序为欧前胡素＝异欧前胡素＞佛手柑内酯。Z-藁本内酯含量高且镇痛作用较强，阿魏酸为偏头痛药效成分之一，且为川芎在《中国药典》2020 年版的质量评价指标成分，故AHP 法赋权时臣药川芎中3 个指标成分的优先顺序为阿魏酸＝Z-藁本内酯＞洋川芎内酯A。同时，根据中药制剂特性，将干膏率纳入质量评价体系。

3.3 设计空间的建立

QbD 理念的核心在于设计空间的建立。常规中药提取工艺多采用单因素实验结合正交实验优选出最佳的工艺参数，并采取固定的提取工艺参数进行生产，易导致不同批次或同一批次间质量波动范围较大。设计空间的构建则是基于风险思维确定CPPs 的可接受范围，在设计空间范围内可根据生产设备条件、原料药材的质量以及不同的环境对工艺参数进行灵活调节，保证中间体、最终产品的质量稳定性。本研究在定义设计空间参数时加入置信水平α＝0.05 的置信区间，建立显著影响因素A、B 的设计空间，分别固定另2 个因素。当固定渗漉体积流量在5 mL/min 时，在浸渍时间12～20 h 过程中设计空间面积随浸泡时间增加的变化幅度明显，而浸泡时间20～36 h 过程中，设计空间面积随浸泡时间增加的变化幅度较缓和。当固定渗漉体积流量在4 mL/min 时，在浸渍时间12～24 h 过程中设计空间面积随浸泡时间增加的变化幅度较缓和；当固定渗漉体积流量在3 mL/min 时，在浸渍时间16～20 h 过程中设计空间面积随浸泡时间增加的变化幅度较缓和。

以综合评分88 分为下限，发现Box-Behnken 实验中满足条件的以渗漉体积流量4、3 mL/min 为绝大多数，浸渍时间12、24 h 为绝大多数，另外在实际实验中渗漉体积流量为5 mL/min 不易控制，渗漉提取工艺参数中的浸渍时间多数为12～48 h[32]。故选择渗漉体积流量4、3 mL/min，浸渍时间12、24 h 分别构建A、B 的设计空间，确定A、B 的操作空间分别为50%～55%、8～10 倍。同时，选择A、B为固定因素，分别以A 为50%、55%和B 为8 倍、10 倍为固定水平，构建影响不显著的渗漉体积流量和浸渍时间的设计空间，结果表明浸渍时间在12～24 h 均可满足优化目标。故结合实际确定最佳提取工艺范围为乙醇体积分数50%～55%、乙醇用量为8～10 倍、渗漉体积流量为3～4 mL/min、浸渍时间为12～24 h。验证实验结果与预测值符合良好，表明在设计空间内操作能保证都梁方渗漉提取液质量的均一可控；设计空间法运用于都梁方渗漉提取工艺稳定可行，为实际大生产中工艺参数的筛选提供思路。

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