基于质谱成像技术的独活鲜根中香豆素类成分的空间分布特征研究

李 欠，姬党通，高 慧

甘肃农业大学农学院，省部共建干旱生境作物学国家重点实验室，甘肃 兰州 730070

独活为伞形科当归属药用植物，根据《中国药典》记载，其为重齿毛当归AngelicapubescensMaxim. f.biserrataShan et Yuan 的干燥根[1]。独活作为中国传统中药，始载于东汉时期的《神农本草经》，已有几千年的用药历史，具有祛风除湿、通痹止痛、解表等功效。独活药材已在医疗、保健、植保和美容化妆等领域取得广泛应用。研究表明，独活含有香豆素、挥发油、多糖和有机酸等多种成分，其中香豆素类成分为其主要成分，具有抗炎、抗凝血、抗癌多种药理活性[2-7]。《中国药典》2020 年版将蛇床子素、二氢欧山芹醇当归酸酯作为独活质量控制的指标性成分。

目前，常采用色谱和色谱-质谱联用等技术对药材中的化学成分进行定性、定量分析和质量控制[8-10]，在药材样品前处理过程中，样品提取液中的部分代谢物会损失，导致在使用该技术进行分析时，造成化学成分检出程度低。除此之外，常用的技术手段也无法实现对药材中代谢物的组织空间分布特征的可视化分析。基质辅助激光解吸质谱成像技术是一种新型的分子成像和原位检测技术，具有免标记，高灵敏度和高通量等优势，被广泛应用于植物代谢物分析和组织分布研究等方面[11-15]。本课题组在前期的研究中采用一测多评法，定量核磁共振波谱法和荧光成像法分析了了独活中香豆素类化合物含量和分布特征[16-18]。本研究采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱成像（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry imaging，MALDI-TOF-MS）技术探讨建立一种可视化原位分析独活根组织中香豆素类化学成分空间分布特征的新方法，为独活代谢物的提取分离、鉴定及探索代谢物的空间信息提供一定的参考。

1 材料与仪器

1.1 仪器

iMScope TRIO 型质谱成像显微镜（日本岛津公司），iMLayer 基质喷涂仪（Shimadzu，Kyoto，日本），氧化铟锡（ITO）导电载玻片（德国Bruker公司），CM1950 冷冻切片机（德国Leica 公司），Agilent 7890B-7000D 型三重四极杆气相色谱质谱联用仪（美国安捷伦公司）。

1.2 试剂

2,5-二羟基苯甲酸（2,5-dihydroxybenzoic acid，DHB）、9-氨基吖啶（9-aminoacridineare，9AA）、α-氰基-4-羟基肉桂酸（α-cyano-4-hydroxycinnamic acid，CHCA）购于美国Sigma 公司，OCT 包埋剂，蛇床子素（批号18032005，质量分数≥98%）、二氢欧山芹醇当归酸酯（批号19091001，质量分数≥98%）、欧前胡素（批号18051502，质量分数≥98%）、氧化前胡素（批号1y27s9s65152，质量分数≥98%），均购于成都普菲德生物技术有限公司；甲醇（色谱醇）。

1.3 样品

新鲜独活药材采集于甘肃省华亭市马峡镇赵庄村两年生人工栽培独活，经甘肃农业大学农学院陈垣教授鉴定为伞形科植物重齿毛当归A.pubescensMaxim. f.biserrataShan et Yuan。前期通过荧光成像分析研究[18]，10 月份是独活根中香豆素含量相对较高的时期，因此本研究选择该时期的独活根进行质谱分析和成像研究。

2 方法

2.1 质谱成像样品的制备

将新鲜独活根清洗干净，取独活主根中段横切成小段（约0.5 cm）。然后将其用OCT 包埋胶包埋。采用冷冻切片机将其切成厚度为25 μm 的独活根组织切片[18]。再单独剥下独活的根皮，最终将切片和根皮负载至ITO 导电玻璃上，真空干燥。

2.2 GC-MS 实验样品的制备

将独活根在40 ℃条件下进行干燥处理，粉碎后过40 目筛。取独活药材粉末材粉末约5 g，精密称定后置于250 mL 蒸馏瓶中，加入甲醇50 mL 后称定总质量。药材粉末经甲醇浸泡30 min 后，采用超声波辅助提取40 min，超声波仪器功率为400 W，频率为40 kHz，经过滤得提取液。提取液经0.22 μm微孔滤膜滤过后用于GC-MS 分析。

2.3 基质和对照品溶液的制备

以70%的甲醇水溶液为溶剂，将CHCA、DHB和9AA 分别配制成10 mg/mL 的基质溶液；将蛇床子素、二氢欧山芹醇当归酸酯、欧前胡素和氧化前胡素等对照品配制成1 mg/mL 对照品混合溶液。

取1 μL 混合对照品溶液滴加至靶板上，待样品点溶剂挥发干燥后，然后分别滴加1 μL 基质溶液，使之覆盖样品点，干燥后进行MALDI-TOF-MS分析。

2.4 基质的喷涂

采用升华喷涂的方法将基质喷涂于组织切片上，条件如下：基质DHB、9-AA 和CHCA 质量为300 mg，厚度为0.5 μm，温度分别为180、220、250 ℃。

2.5 MALDI-TOF-MS 分析

首先将组织切片放置于图像扫描仪中进行拍照和成像定位，然后将喷涂基质的组织切片置于MALDI-TOF-MS 型质谱成像仪中分别在正离子和负离子模式进行成像分析研究。

MALDI-TOF-MSI 数据是使用成像质谱仪（岛津iMScope TRIO）获得的，该质谱仪配备有内部光学显微镜和355 nm Nd: YAG 激光源。

使用Imaging MS Solution version 1.30 软件（岛津）记录和分析分子图像。经条件优化后，在正电离模式下测量m/z100～500 的离子。激光直径设置为 1（约10 μm，是 iMScope 的任意单位）。MALDI-TOF-MSI 的其他相关参数如下：探测器电压1.87 kV；采样电压3.50 kV；累计1 次/像素；激光重复频率1000 Hz；激光射击80 次；间距为（35×35）μm2；激光强度为25。

2.6 GC-MS 分析

2.6.1 气相色谱条件 色谱柱HB-23毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），载气为氦气，分流比5∶1，体积流量1 mL/min。35～150 ℃，升温速度为8 ℃/min，升至150 ℃后保持1 min；150～250 ℃，升温速度为4 ℃/min，升温至250 ℃后保持12 min。

2.6.2 质谱条件 进样口温度250 ℃，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃；电离方式为EI 源，电子能量为70 eV；离子检测模式：选择性离子检测（selected ion monitor，SIM）；扫描范围m/z50～650。

3 结果与分析

3.1 基质的选择与优化

在基质辅助的质谱成像研究过程中，基质的选择是至关重要的。基质不仅会影响待分析物的解析、离子化，还会影响成像效果。根据文献报道[5]独活富含香豆素类化合物，其中蛇床子素、二氢欧山芹醇当归酸酯、欧前胡素、氧化前胡素、异欧前胡素等成分含量较高。本研究以上述化合物为对照品分别在正、负2 种离子检测模式下对基质DHB、9-AA和CHCA 进行筛选。由图1 可知，DHB 和9-AA 基质会影响蛇床子素的离子化程度，并且对分析物的质谱信号产生干扰。结果表明CHAA 适合蛇床子素和其他香豆素类化合物的质谱成像分析。由图2 可知，正、负2 种离子模式检测条件下，正离子模式下检出的化合物种类多，分析物离子峰的相对峰强度更高。因此本研究在正离子检测模式下选择CHCA 进行独活质谱成像分析。

图1 蛇床子素在不同基质下的信号强度Fig. 1 Signal intensity of osthol in different substrates

图2 CHCA 基质辅助下混合对照品在正 (A) 和 负 (B) 离子模式下质谱图Fig. 2 Mass spectrum of mixed reference substance in positive (A) and negative (B) ion modes assisted by CHCA matrix

3.2 独活根组织中香豆素类化合物的MALDITOF-MS 质谱成像分析

本研究在正离子模式下对独活根和根皮进行MALDI-TOF-MS 质谱成像分析，质谱图见图3。

图3 独活鲜根 (A) 和根皮 (B) 的质谱图Fig. 3 Mass spectra of roots (A) and root bark (B) of Angelica pubescens

由表1 可知，在CHCA 作为基质，正离子模式下经MALDI 质谱成像分析，独活根及根皮分别鉴定出25 和28 个香豆素类成分[5,18-28]。其中欧前胡素和异欧前胡素、补骨脂素和异补骨脂素、花椒毒素和佛手苷内酯分别为同分异构体，由文献报道[28]可知，这些同分异构体均存在于独活中，仅仅通过质谱技术无法区分它们，必须与核磁共振等技术手段结合才能鉴别。在鉴定出的28 个化学成分中，二氢欧山芹醇、月橘香豆素、异茴芹内酯和橙皮内酯水合物仅在根皮中检测到，未在根横切片面组织切片中检测到上述化合物的特征离子。独活根组织在制备切片过程中受到了一定程度的破坏，影响了切片的完整度，导致未检测出部分化合物的质谱信号。本研究还采用GC-MS 分析手段分析了独活根的提取物中的成分。根中分析鉴定出了59 种化合物，包括香豆素类化合物、醇酚类化合物、酯类化合物、烯烃类化合物和脂肪酸类化合物。其中香豆素类化合物为主要化合物（表2），蛇床子素、二氢欧山芹素、二氢欧山芹醇当归酸酯、花椒毒素、补骨脂素和橙皮内酯等与质谱成像分析结果一致。面积归一法定量结果表明，蛇床子素为最主要成分，占31.62%，总香豆素占比超过40%。

表1 独活鲜根及根皮中香豆素类化学成分Table 1 Chemical constituents of coumarins in the roots and roots bark at A. pubescens

续表1

表2 独活化学成分分析Table 2 Chemical composition analysis of A. pubescens

3.3 独活根组织中香豆素类成分的空间分布特征

独活中化学成分的研究集中于香豆素类化合物，主要包括：以蛇床子素、二氢欧山芹醇当归酸酯和二氢欧山芹醇乙酸酯等为代表的化学成分。在优化的条件下，将制备好的独活根组织切片喷涂基质后进行MALDI 质谱成像分析，在分析软件中靶向提取香豆素类化合物的离子类型，离子峰通过质谱成像图的构建，其中香豆素类化合物代表性成分的质谱成像图如图4～6 所示。由图4 可知，独活根中以蛇床子素为代表性香豆素类化合物的分布与荧光成像分析结果基本一致，主要分布在分泌腔、分泌道等分泌组织中。其中蛇床子素（[M＋H]+，m/z245.12）、东莨菪内酯（[M＋K]+，m/z231.14）、白花前胡醇（[M＋Na]+，m/z301.10）、紫花前胡素（[M＋Na]+，m/z359.06）、佛手酚（[M＋K]+，m/z241.09）和川白芷素（[M＋H]+，m/z229.09）等在韧皮部分泌腔中的强度最高，在其他部位也有少量分布。

图5 分泌腔外香豆素类化合物的质谱成像图Fig. 5 Mass spectrometry image of coumarin compounds out of secretory cavity

图6 独活鲜根中香豆素类化合物的质谱成像图Fig. 6 Mass spectrometry image of coumarin compounds in A. pubescens fresh roots

由图5 可知，二氢欧山芹醇当归酸酯（[M＋Na]+，m/z245.12）、二氢欧山芹醇乙酸酯（[M＋H]+，m/z291.11）、白当归素（M，m/z336.11）和新比克白芷内酯（[M＋H]+，m/z317.10）与上述化合物不同，在分泌腔中强度最低，主要分布在除分泌腔以外的木质部和韧皮部。此外，这4 种成分根皮部位的离子强度较大，含量较高。

如图6 所示，欧芹酚（[M＋Na]+，m/z254.09）等其他成分在整个根部分布较为均匀，无明显差异。

4 讨论

传统的GC/LC-MS技术需要对待测样品进行匀浆，导致被分析物的空间信息丢失；此外，天然活性成分通常需要使用有机溶剂从植物中提取出来进行分析，耗时耗力，还容易造成不稳定成分的分解。MALDI-TOF-MSI 技术作为一种重要的分子成像技术，具有样品前处理简单、免标记、高覆盖、高灵敏度和高通量等优势，被广泛应用于蛋白质、多肽和小分子代谢物的组织分布研究。本实验通过采用CHCA 作为基质，正离子模式下实现了独活根中香豆素类成分的质谱成像分析，检测到28 个香豆素类成分，并得到其空间分布信息。通过质谱成像可以实现对单个香豆素化合物空间分布特征的研究，为独活的鉴定、提取分离等研究提供指导。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突