玄参药材中多类型成分的定量分析方法建立及其在脉络宁口服液中的应用

2023-06-08徐思易谭亚杰唐浩竣谭宁华

中草药 2023年11期

徐思易，谭亚杰，唐浩竣，李剑,2*，谭宁华*

1. 中国药科大学中药学院，江苏南京 211198

2. 金陵药业股份有限公司，江苏南京 210009

脉络宁口服液（Mailuoning Oral Liquid，MOL）为江苏省中医药研究所顾亚夫教授课题组在临床实践的基础上所研制，由金陵药业股份有限公司独家生产，具有清热养阴、活血化瘀的功效。处方由君药牛膝、臣药玄参、佐药石斛、使药金银花和山银花5 味中药材组成，临床上常用于治疗血栓闭塞性脉管炎、静脉血栓形成、动脉硬化性闭塞症、脑血栓形成及其后遗症。臣药玄参来源于玄参科玄参属植物玄参ScrophularianingpoensisHemsl.的干燥根[1]。研究表明，玄参提取液具有保护脑缺血损伤[2-4]、抗动脉粥样硬化[5]和免疫调节[6]等药理活性。因此，玄参的化学成分可能为MOL 发挥药效的关键成分，其药材质量优劣将直接影响其临床疗效。目前玄参的成分分析和含量测定方法主要用于药材的产地差异[7]、规格等级[8-9]、加工方法[10-13]和药用部位[14-15]等的质量评价，其成分分析主要集中在一类或少数几个指标性成分考察。迄今为止，尚未见同时定量玄参中4 类有效成分，如环烯醚萜苷、苯丙素苷、有机酸及核苷类等，用于评价不同产地药材质量的相关报道。

基于玄参药材成分复杂且部分定量的成分含量低，本研究采用超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱（UPLC-QqQ-MS/MS）方法在多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）模式下，首次建立玄参中环烯醚萜苷、苯丙素苷、有机酸及核苷4 类有效成分的分析方法，并将此方法首次应用于MOL，实现了玄参药材中25 个成分和MOL 中15个成分的同时定量。结合化学计量学方法对不同产地玄参药材和不同批次MOL 进行质量评价，旨在为MOL 组方中玄参药材的选择及其复方的质量控制提供更多科学依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Waters Acquity®UPLC H-Class 超高效液相色谱仪，Waters XEVO®TQD system 型三重四极杆质谱仪，美国沃特世公司；KQ-200KDE 型数控超声清洗器，昆山市超声仪器有限公司；XS105 型十万分之一电子天平，梅特勒-托利多公司。

1.2 材料

对照品腺苷（R1，批号N24D11W135689）和对甲氧基肉桂酸（R22，批号A31J10L94348）购自上海源叶生物科技有限公司；2′-脱氧腺苷（R2，批号AF21081054）、鸟苷（R3，批号AF20073153）和地黄苷（R18，批号AF21102904）购自成都埃法生物科技有限公司；桃叶珊瑚苷（R4，批号DSTDT000401）、哈巴苷（R5，批号DST210329-059）、原儿茶酸（R6，批号DSTDY008101）、对羟基苯甲酸（R7，批号DSTDD011401）、对香豆酸（R9，批号DSTDD005701）、异毛蕊花糖苷（R13，批号DST210601-060）、安格洛苷 C（R14，批号DST211010-009）、哈巴俄苷（R20，批号DST220312-058）和肉桂酸（R21，批号DSTDG016801）购自成都德斯特生物科技有限公司；咖啡酸（R8，批号PRF20070342）购自成都普瑞法科技开发有限公司；毛蕊花糖苷（R10，批号20122101）购自成都普菲徳生物科技有限公司；阿魏酸（R12，批号110773-201915）购自中国食品药品检定研究院；斩剑龙苷A（R11）、肉苁蓉苷C（R15）、8-O-对香豆酰基哈巴苷（R16）、1-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl) ethyl-3-α-L-rhamnopyranosyl-6-caffeoyl-β-D-glucopyranoside（R17）、异地黄苷（R19）、scrophuloside A4（R23）、scrophuloside B4（R24）和keolzioside（R25）由本实验室提供。以上购买的对照品质量分数≥98%，自制的对照品质量分数≥95%。乙腈（德国Merck公司）和甲酸［赛默飞世尔科技（中国）有限公司］均为LC-MS 级，水为Milli-Q 系统制备的超纯水，其余试剂为分析纯。

重庆市（S1、S2）、贵州省（S3～S5）、浙江省（S6～S8）与河南省（S9、S10）产地的玄参药材由金陵药业股份有限公司提供；河北省（S11～S13）、湖北省（S14～S16）与安徽省（S17～S19）产地的玄参药材购买于亳州药材市场。玄参药材由中国药科大学中药学院谭宁华教授鉴定为玄参科玄参属植物玄参S.ningpoensisHemsl.的干燥根。53 批MOL由金陵药业股份有限公司提供，样品信息见表1。

表1 53 批MOL 样品信息Table 1 Sample information of 53 batches of MOL

2 方法与结果

2.1 色谱与质谱条件

2.1.1 色谱条件采用Waters Acquity UPLC®HSS T3 色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流动相为0.1%甲酸水溶液和乙腈，梯度洗脱：0～3.0 min，0～10%乙腈；3.0～5.0 min，10%～20%乙腈；5.0～12.0 min，20%～30%乙腈；12.0～13.0 min，30%～100%乙腈；13.0～15.0 min，100%乙腈；体积流量0.3 mL/min；柱温30 ℃；进样量2 μL。

2.1.2 质谱条件电喷雾（electrospray ionization，ESI）离子源，电离模式ESI+/ESI-，扫描方式采用多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）模式，脱溶剂气体积流量650 L/h；脱溶剂气温度650 ℃；离子源温度150 ℃；锥孔体积流量50 L/h；毛细管电压2.0 kV；25 个成分优化后的质谱参数见表2。各成分在混合对照品溶液和样品溶液中的总离子流图见图1，叠加后的MRM 色谱图见图2。

表2 25 种成分的MS/MS 参数Table 2 MS/MS parameters of 25 compounds

2.2 对照品溶液的制备

分别精密称定25 个对照品适量，加70%甲醇制成各对照品储备液。取各对照品储备液适量，制成R1～R25 质量浓度分别为20.00、0.084、4.70、40.00、388.80、12.90、5.50、31.20、10.30、72.00、20.00、10.10、18.56、320.00、16.00、10.80、10.50、10.00、5.25、153.60、63.60、5.05、5.40、11.30、5.30 μg/mL 的混合对照品溶液，置于4 ℃下保存，备用。

2.3 供试品溶液的制备

2.3.1 玄参药材供试品溶液取玄参药材粉末（过50 目筛）约0.5 g，精密称定，置100 mL 具塞锥形瓶中，精密移取70%甲醇30 mL，密塞，称量，超声处理40 min（200 W、40 ℃），放冷，称量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，过0.22 μm 有机滤膜，取续滤液，即得玄参药材供试品溶液。

图1 化合物R1～R25 (1～25) 在混合对照品 (A)、玄参药材 (B) 和MOL (C) 中的总离子流图Fig. 1 Total ion chromatograms of compounds R1—R25 (1—25) in mixed standard solutions (A), Scrophulariae Radix (B) and MOL (C)

图2 化合物R1～R25 (1～25) 在混合对照品 (A)、玄参药材 (B) 和MOL (C) 中的MRM 色谱图Fig. 2 MRM chromatograms of compounds R1—R25 (1—25) in mixed standard solutions (A), Scrophulariae Radix (B) and MOL (C)

2.3.2 MOL 供试品溶液精密吸取MOL 1 mL，置10 mL 量瓶中，加水定容至刻度线，摇匀，过0.22 μm 有机滤膜，取续滤液，即得MOL 供试品溶液。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系、检测限与定量限考察取“2.2”项下混合对照品溶液，按2 倍逐级稀释得HB-1～HB-12，于上述“2.1”项下的条件下测定。以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归分析，绘制标准曲线（至少6 个质量浓度点），以信噪比S/N＝3 和S/N＝10 分别计算检测限和定量限。结果见表3，表明25 个化合物在线性范围内线性关系良好。

表3 25 个化合物的线性关系考察结果Table 3 Linear range investigation of 25 compounds

2.4.2 精密度考察取同一混合对照品溶液，按照“2.1”项的条件连续进样6 次，计算各成分峰面积的RSD，得日内精密度；连续3 d 精密吸取同一混合对照品溶液，重复进样6 次，计算各成分峰面积的RSD，得日间精密度。结果表明，R1～R25 日内的RSD 分别为1.84%、2.08%、0.83%、1.61%、1.22%、1.90%、2.65%、1.93%、4.08%、2.47%、2.45%、1.77%、1.97%、1.39%、2.46%、2.09%、2.48%、3.07%、2.40%、3.67%、1.50%、5.65%、4.41%、5.99%、4.38%，日间的RSD 分别为3.77%、2.66%、4.26%、5.74%、7.42%、3.74%、3.72%、1.38%、7.33%、7.09%、10.41%、6.08%、7.11%、5.42%、6.78%、5.38%、6.03%、7.34%、5.44%、4.45%、4.35%、7.76%、4.26%、4.98%、2.12%，表明仪器精密度良好。

2.4.3 重复性考察按“2.3”项下方法分别平行制备6 份玄参药材（S1）和MOL（M26）的供试品溶液，计算6 份玄参提取液中各成分峰面积/取样量的RSD 和MOL 样品中各成分峰面积的RSD。结果显示，玄参药材中R1～R25 的RSD 分别为1.93%、4.29%、2.16%、2.26%、1.02%、4.22%、3.16%、4.76%、4.90%、0.95%、1.66%、3.24%、2.40%、2.40%、1.09%、2.43%、3.14%、2.96%、5.27%、3.57%、0.93%、1.25%、2.75%、3.77%、2.22%，MOL 中R1、R3、R5～R9、R11～R13、R17、R19～R22 的RSD 分别为1.00%、2.58%、3.01%、2.45%、3.05%、0.66%、1.51%、2.67%、1.87%、2.92%、2.14%、7.71%、7.57%、2.75%、5.14%，表明该方法重复性良好。

2.4.4 稳定性考察取同一份供试品溶液，按照“2.1”项下条件分别于0、2、4、8、12、24 h 进样分析，计算各成分峰面积的RSD。结果显示，玄参药材样品（S1）中R1～R25 的RSD 分别为2.15%、6.13%、3.23%、4.88%、2.75%、8.82%、6.94%、3.91%、3.50%、2.24%、4.02%、5.90%、5.23%、4.10%、4.47%、5.45%、4.08%、5.91%、7.02%、1.99%、2.82%、6.03%、5.69%、9.91%、2.04%，MOL（M26）中R1、R3、R5～R9、R11～R13、R17、R19～R22 的RSD 分别为1.70%、1.26%、2.88%、0.98%、2.40%、0.94%、1.99%、5.01%、0.91%、2.21%、2.56%、3.00%、3.43%、1.39%、4.82%，结果表明，供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.4.5 加样回收率考察分别精密称定已测定指标成分含量的0.25 g 玄参药材样品（S1）9 份和精密吸取已测定指标成分含量的0.5 mL MOL 样品（M26）9 份，每3 份1 组。分别按照低、中、高3个水平（50%、100%、150%）精密加入对照品溶液，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下的条件进样分析，计算加样回收率。结果显示，玄参药材中 R1～R25 的平均加样回收率分别为97.10%、91.82%、112.22%、84.80%、84.75%、87.90%、108.27%、107.69%、98.92%、101.40%、98.51%、104.42%、104.66%、104.74%、89.82%、111.28%、107.02%、100.79%、86.35%、110.01%、101.65%、107.10%、104.04%、107.72%、109.49%，RSD 分别为5.52%、3.54%、7.20%、4.12%、5.09%、5.51%、7.84%、6.00%、6.66%、1.56%、1.38%、7.02%、2.66%、3.87%、3.13%、3.32%、3.55%、2.57%、6.54%、9.48%、1.75%、6.14%、6.91%、9.01%、4.11%；MOL 样品中R1、R3、R5～R9、R11～R13、R17、R19～R22的平均加样回收率分别为 106.20%、94.06%、111.92%、97.42%、105.71%、100.64%、86.09%、105.02%、100.34%、101.61%、106.47%、92.74%、102.90%、105.82%、93.28%，RSD 分别为4.28%、3.44%、8.52%、4.38%、4.34%、2.61%、7.47%、3.35%、8.33%、7.39%、5.34%、3.83%、7.48%、3.09%、4.32%；结果表明该方法准确度较高。

2.5 样品含量测定

取不同批次玄参药材样品和MOL 样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下条件进样分析。根据回归方程计算各化合物的含量，各批次样品含量见表4、5，叠加示意图如图3、4 所示，不同产地玄参药材和不同年份的MOL 中各成分总含量有明显差异。玄参药材中25 种成分的总含量以华北地区（河北省）为最高，浙江省次之。MOL 2021 和2022 年样品中15 种成分的总含量整体高于2019 年和2020 年的样品。

图3 19 个批次玄参药材样品中25 种成分含量的叠加示意图Fig. 3 Overlay diagram of contents of 25 compounds in 19 batches of Scrophulariae Radix samples

图4 53 个批次MOL 样品中15 种成分含量的叠加示意图Fig. 4 Overlay diagram of contents of 15 compounds in 53 batches of MOL samples

表4 19 个批次玄参药材样品中25 种成分的含量Table 4 Contents of 25 compounds in 19 batches of Scrophulariae Radix samples

表5 53 个批次MOL 样品中15 种成分的含量Table 5 Contents of 15 compounds in 53 batches of MOL samples

续表5

2.6 化学计量学分析

2.6.1 聚类分析（cluster analysis，CA）采用HemI软件对不同批次样品的化学成分含量进行聚类热图分析，数据进行归一化取对数值后再进行双向聚类，结果见图5 和6。19 批玄参药材样品按地域被分为4 类：西南地区（重庆S1、S2，贵州S3～S5）为第1 类，华东沿海地区（浙江S6～S8）为第2 类，华东内陆和华中地区（安徽S17～S19，河南S9、S10，湖北S14～S16）为第3 类，华北地区（河北S11～S13）为第4 类，说明玄参药材样品中各成分的含量可能与其生长环境相关。53 批MOL 样品被分为2类：过期样品（M1～M11）为第1 类，含量相对较低；未过期样品（M12～M53）为第2 类，含量相对均匀，表明MOL 在有效期内各成分含量较接近，过期样品中各成分含量下降。此外，2 类中不同年份的样品又可再聚成一小类，可能是当年使用的药材质量相对稳定使其含量更相近。

图6 53 个批次MOL 样品中15 种成分含量的聚类热图Fig. 6 Cluster analysis of contents of 15 compounds in 53 batches of MOL samples

2.6.2 主成分分析（principal component analysis，PCA）将不同批次样品各化合物峰面积导入SIMCA 14.1 软件，进行PCA，见图7-A 和8-A。玄参药材样品大致分为2 类，华北地区（河北省）玄参药材样品单独为一类，能很好地与其他地区分开，这与聚类结果一致，但是其余地区玄参药材样品区分不明显，可能是因为第1 和第2 主成分并未包含全部的变量信息。MOL 被分为4 类：2019 年、2020年、2021 年与2022 年的样品分别聚成一类，说明不同年份的MOL 中各成分存在一定差异，与聚类分析结果基本一致。

图7 玄参药材样品的PCA 得分散点图 (A) 和OPLS-DA 得分散点图 (B)Fig. 7 PCA scatter plot (A), and OPLS-DA scatter plot (B) of Scrophulariae Radix samples

图8 MOL 样品的PCA 得分散点图 (A) 和OPLS-DA 得分散点图 (B)Fig. 8 PCA scatter plot (A) and OPLS-DA scatter plot (B) of MOL samples

2.6.3 正交偏最小二乘-判别分析（orthogonal partial least squares method-discriminant analysis，OPLS-DA）为更好地区分不同批次玄参药材和MOL 样品组间差异，寻找组间差异性化学成分，进一步对不同批次样品进行OPLS-DA，见图7-B 和8-B。玄参药材样品和MOL 样品的分类结果与PCA 结果一致，即华北地区（河北省）的玄参药材样品明显区分于其他地区；不同年份的MOL 样品中各成分含量存在一定差异，但同一年份的MOL 样品中各成分含量相近。

为进一步筛选出不同年份MOL 样品间差异性化学成分，以变量重要性投影值（variable importance projection，VIP＞1）对各成分进行筛选。结果如图9 所示，共得到7 个差异性化合物，分别为异毛蕊花糖苷（R13）、对甲氧基肉桂酸（R22）、腺苷（R1）、1-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)ethyl-3-α-Lrhamnopyranosyl-6-caffeoyl-β-D-glucopyranoside（R17）、对羟基苯甲酸（R7）、阿魏酸（R12）和原儿茶酸（R6）。然而，在玄参药材样品的OPLS-DA模型中，除河北省（S11～S13）能与其他产地明显区分外，其余产地的分类效果并不明显，所以未进一步采用VIP 值筛选其差异性成分。

图9 MOL 样品中15 种成分含量的VIP 值Fig. 9 VIP values of contents of 15 compounds in MOL samples

3 讨论

3.1 指标性成分的选择

玄参主要以环烯醚萜苷、苯丙素苷和有机酸类为其主要成分[16]。现代药理学研究表明，环烯醚萜苷、苯丙素苷和有机酸具有抗心肌细胞损伤、保护脑缺血损伤和抗动脉粥样硬化等药理活性[4,16-19]。环烯醚萜苷、苯丙素苷和核苷类成分是玄参滋阴的物质基础，具有免疫调节的活性[6,11,20]，其中环烯醚萜苷和苯丙素苷可通过调节阴虚小鼠的能量代谢、免疫力和氧化应激而发挥滋阴的功效。基于此，本研究选择环烯醚萜苷、苯丙素苷、有机酸和核苷4 类有效成分作为含量测定的指标性成分。

3.2 玄参药材供试品溶液提取条件的优化

为提高各待测成分在定量分析中的准确度，本研究采用单因素实验考察提取溶剂（水、甲醇、乙醇）、甲醇体积分数（30%、50%、70%、100%）、液料比（10∶1、20∶1、40∶1、60∶1、80∶1）、超声时间（20、30、40、50、60 min）、超声功率（80、120、160、200 W）及超声温度（25、40、55、70 ℃）对玄参中环烯醚萜苷、苯丙素苷、有机酸和核苷类成分提取率的影响。

环烯醚萜苷类成分的含量为R4、R5、R16、R20与R23～R25 之和，苯丙素苷类成分的含量为R10、R11、R13～R15 与R17～R19 之和，有机酸类成分的含量为R6～R9、R12 与R21、R22 之和，核苷类化合物的含量为R1～R3 之和。结果表明，甲醇体积分数和超声条件对各类成分的提取率影响不明显，而料液比则呈现先上升后趋于平缓的趋势且在60∶1 时各类成分的提取率最大。综合考虑提取率和时间，本实验选用70%甲醇，液料比60∶1，超声处理40 min（200 W、40 ℃）作为玄参样品的提取条件。

3.3 含量测定结果的分析

玄参药材样品的化学计量学分析结果表明，CA可很好地区分4 个地区玄参药材样品，PCA 和OPLS-DA 虽然没有CA 分类效果好，但也可明显区分华北地区（河北省）和其他地区的玄参药材样品。说明玄参药材的质量受生长环境影响是客观存在的，且以华北地区（河北省）的玄参药材质量最优。此外，3 种化学计量学模型表明，不同年份的MOL样品中各成分含量存在一定差异，但同一年份MOL样品中各成分含量相近，可能是当年使用的药材质量相对稳定。该方法也可为MOL 的质量控制提供参考。

此外，本实验是采用质谱技术对玄参药材和MOL 样品中的多类型成分进行定量分析，虽然可为玄参药材和MOL 的质量控制提供科学依据，但使用的仪器昂贵且部分定量的化合物是经本课题组分离纯化得到。因此，从研究手段和定量成分方面，该方法的普适性还有待进一步加强。但本研究在建立OPLS-DA 模型后，以VIP 值筛选得到的不同年份MOL 的差异性化合物，可作为MOL 的质量控制标志物用于其质量控制。目前，企业仅通过HPLC法测定肉桂酸含量评价MOL 的质量，检测的成分单一，今后可考虑加入本实验中筛选得到的质量控制标志物，建立更全面的多成分定量的HPLC 法用于提高MOL 的整体质量。