体外定点突变体或CRISPR/Cas9介导的敲入突变体快速筛选方法的建立

宋春林 张雨晴 翟玉静 张刚 王颖

(青岛大学,山东 青岛 266071 1 肿瘤精准医学研究院; 2 公共卫生学院)

通过引入突变进行基因功能的研究是常用的实验方法,基因突变可以发生在细胞内或细胞外。目前,鉴定突变体的通用方法是通过聚合酶链式反应(PCR)扩增含有突变位点的基因组DNA片段,然后进行DNA测序以确定突变是否成功,实际操作成本高且耗时长[1］。使用传统方法在基因组上实现基因突变的难度很高,近年来CRISPR/Cas9系统在基因编辑中的成功应用为实现基因突变提供了更快捷精准的手段[2-5］。然而,CRISPR/Cas9系统介导的基因组定点突变的效率受到多种因素影响,包括细胞类型、基因拷贝数、突变类型以及基因组位点等[6-8］,科研成本相对较高。

为了解决基因定点突变的鉴定问题,本研究旨在构建一种使用突变引物进行PCR扩增的突变体筛选方法,即在引物3′端的1～3个碱基处引入与突变序列相匹配的核苷酸,分别检验它们对细胞外和细胞内突变的检测效率。相较于传统的测序方法,该方法可快速高效地检测正确的体外定点突变体或CRISPR/Cas9介导的敲入突变体,可简化实验步骤,达到有效提高筛选效率和节省实验成本的目的。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂

HCT116和LN299细胞购自中国科学院苏州生物研究创新中心;DH5α大肠杆菌细胞购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司;胎牛血清购自美国BI公司;胰蛋白酶、DMEM培养基、青链霉素混合液和转染试剂Lipofectamine 2000购自美国Ther-mo Fisher Scientific公司;单链寡核苷酸(ssODN)购自美国IDT公司。

1.2 细胞培养

DH5α大肠杆菌细胞培养于含50 mg/L氨苄青霉素的LB培养基中,置于37 ℃恒温培养箱中培养。HCT116和LN299细胞培养于含体积分数0.1的胎牛血清和含有抗生素(青霉素10 kU/L,链霉素0.01 g/L)的DMEM培养基中,置于37 ℃、含体积分数0.05 CO2的恒温培养箱中常规培养,以备后续实验使用。

1.3 体外定点突变体的构建

使用含有突变位点的引物对于包含有目标基因的质粒进行定点突变PCR。PCR反应的总体积为25 μL:0.5 μL模板(质量浓度5×10-5g/L),1 μL引物(每条,摩尔浓度为10 μmol/L),2 μL dNTPs, 1.5 μL MgSO4,2.5 μL 10×PCR Buffer,0.5 μL KOD-Plus-Neo(TOYOBO,日本)和16 μL ddH2O。反应条件为:94 ℃预变性3 min;然后98 ℃变性15 s,51 ℃退火30 s,68 ℃延伸4 min,共进行34个循环;最后68 ℃延伸5 min。PCR反应结束后加入1 μL DpnI,37 ℃孵育1 h以消化PCR反应体系中的质粒模板,后将PCR产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α涂平板后,于37 ℃恒温培养箱过夜培养至形成单菌落,次日挑选单菌落进行菌落PCR,鉴定正确突变体。本研究所用引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成,引物序列见表1。

1.4 体外定点突变体的筛选

菌落PCR反应的总体积为7 μL:1 μL引物(每条,浓度为10 μmol/L),3.5 μL的2×Taq Plus Master Mix II(Vazyme,中国)和1.5 μL的ddH2O。反应条件为:94 ℃预变性3 min;然后 94 ℃变性30 s,62 ℃退火30 s,72 ℃延伸2 min,共进行34个循环;最后72 ℃延伸5 min。PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳观察是否有DNA扩增条带。引物序列见表1。

1.5 CRISPR/Cas9介导的敲入突变体的构建

以PX459为载体构建靶向c-Jun外显子1的质粒。以单链寡核苷酸为模板DNA,在基因组中引入P244A突变。首先将饱和度40%的HCT116细胞接种于6孔板上;次日将PX459和模板DNA各2 μg加入到Lipofectamine 2000中进行细胞转染;24 h后加入1 mg/L嘌呤霉素进行筛选,筛选48 h后用普通DMEM培养基继续培养细胞至形成单克隆,以备用于后续基因组DNA提取。同样的方法也应用于LN299细胞HDAC1的Y87F突变。

1.6 基因组DNA的提取

收集约100 000个LN299或者HCT116细胞,PBS缓冲液洗涤以后重悬于150 μL的5 mmol/L Tris-HCl (pH 8.8)中,95 ℃孵育10 min。细胞裂解液冷却至室温后,加入30 μg蛋白酶K,56 ℃孵育30 min以后,95 ℃孵育10 min。以13 000 r/min离心2 min,将含有基因组DNA的上清液转移到新的离心管中,于-20 ℃保存,以备用于后续的基因组PCR鉴定。

1.7 CRISPR/Cas9介导的敲入突变体的筛选

以200 ng HCT116或LN299基因组DNA为模板,使用3′端最后1、2或3个核苷酸与突变序列相匹配的筛选引物(HDAC1-1、HDAC1-2、HDAC1-3)进行基因组PCR。反应体系为12 μL:2 μL模板,1 μL引物(每条,浓度为10 μmol/L),6 μL的2×Taq Plus Master Mix II和2 μL的ddH2O。反应条件为:94 ℃预变性3 min;然后94 ℃变性30 s,64 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共进行34个循环;最后72 ℃延伸5 min。基因组PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳观察是否有扩增条带。其后通过提高退火温度和在引物的3′端引入新突变的方法进一步优化HDAC1-1引物的检测特异性。引物序列见表1。

1.8 DNA测序

按照1.6中的方法提取HCT116或LN299细胞基因组DNA,使用位于预期敲入位点的上游和下游约200 bp处的引物进行PCR扩增,对扩增产物进行测序。引物序列见表1。

1.9 不同DNA聚合酶扩增效率的检验

分别使用普通Taq酶2×Hieff®PCR Master Mix with dye(YEASEN公司,中国)、2×Taq Plus Master Mix II dye plus(Vazyme公司,中国),高保真DNA聚合酶2×Hieff Canace®Plus PCR Master Mix with dye(YEASEN公司,中国)、2×Phanta Flash Master Mix dye plus(Vazyme公司,中国)、KOD OneTM PCR Master Mix(TOYOBO公司,日本)对突变体进行PCR检测,通过比较扩增条带的强度确定不同DNA聚合酶的扩增效率。

2 结 果

2.1 细胞外突变的检测结果

使用3′端包含突变基因序列的正向引物和下游DNA序列的反向引物,分别检测了构建在pcDNA5/FRT/To载体上3个基因的定点突变。第一个是VRK1基因发生了抗RNA干扰突变:分别以正确突变基因和未成功突变基因的菌落为模板,使用3′端与第1个突变位点(A→G)匹配的正向引物(5′-CATGGCAAAAAAGGAG-3′)和下游DNA序列的反向引物进行菌落PCR反应,正确突变基因的PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳显示有大小约为1 100 bp的强DNA扩增条带,未成功突变基因则没有扩增条带(图1A、B);第2个是BubR1基因发生L669A/I672A突变:分别以正确突变基因以及未成功突变基因的菌落为模板,使用3′端与突变位点(CT→GC)匹配的正向引物(5′-TCAGCATCAAGAAGGC-3′)和下游DNA序列的反向引物进行菌落PCR反应,正确突变基因的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,显示有大小约1 300 bp的强信号条带,未成功突变基因则没有扩增条带(图1C、D);第3个是Cdc20基因发生C165E突变:分别以正确突变基因和未成功突变基因的菌落为模板,使用3′端与突变位点(TGT→GAA)匹配的正向引物(5′-CAGCCGCAAAACGGAA-3′)和下游DNA序列的反向引物进行菌落PCR反应,正确突变基因的PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳,显示有大小约1 000 bp的强信号条带,未成功突变基因则没有扩增条带(图1E、F)。

2.2 细胞内突变的检测结果

当使用只有一个核苷酸匹配突变序列的引物HDAC1-1时,亲本基因组扩增得到弱信号条带,同时敲入基因组扩增出强信号条带;使用HDAC1-2、HDAC1-3时,只有敲入突变基因组产生强信号的条带,亲本基因组无扩增(图2A、B)。进一步优化HDAC1-1引物的检测特异性发现,升高退火温度,敲入突变基因组与亲本基因组条带的强度比不断增加,当退火温度设置为70 ℃时,两者的扩增均告失败(图2C)。

进一步优化实验显示,在只有1个核苷酸与突变序列匹配的引物的3′端倒数第2、3和4位分别引入新的突变,也能够提高反应的特异性(图3)。

最后,采用该方法成功地筛选出在HCT116细胞的c-Jun基因上发生P244A(CCC→GCT)敲入突变成功的克隆(图4A、B)。

A:HDAC1野生型(顶部)与突变型(底部)的序列比对;B:野生型HDAC1的亲本细胞基因组(第1、3、5泳道)和HDAC1 Y87F敲入突变细胞基因组(第2、4、6泳道)PCR结果,1与2,3与4、5与6泳道的反应分别使用HDAC1-1、HDAC1-2、HDAC1-3引物;C:优化HDAC1-1引物的退火温度的结果,第1、3、5、7、9和11泳道为野生型HDAC1,第2、4、6、8、10和12泳道为突变型HDAC1

野生型HDAC1的亲本细胞基因组(第1、3、5、7、9泳道)和HDAC1 Y87F敲入突变基因组(第2、4、6、8、10泳道)的PCR扩增结果;1与2、3与4、5与6、7与8、9与10泳道分别使用HDAC1-1,HDAC1-1-2、HDAC1-1-3、HDAC1-1-4和HDAC1-1-5(倒数第5位引入新突变)引物

A:野生型(顶部)与突变型c-Jun(底部)的DNA序列比对;B:使用3′端含有4个突变核苷酸的反向引物,对32个细胞株(1～32泳道)进行基因组PCR,33～35泳道分别为亲本细胞、敲入后的混合细胞和c-Jun阳性对照的PCR扩增结果

2.3 不同DNA聚合酶检测效率的比较

为提高该方法的扩增效率,本研究比较了5种不同DNA聚合酶对于突变体检测的效率,结果表明普通的Taq酶较高保真DNA聚合酶,更适用于突变克隆的筛选(图5)。

3 讨 论

DNA突变是研究基因功能的常用方法,但通过DNA测序找到正确的突变体往往需要耗费大量时间和金钱,尤其是在突变成功率偏低的情况下。随着CRISPR/Cas9介导的敲入突变方法越来越广泛地应用,这个问题变得越来越突出。因此,设计新的方法以提高突变克隆鉴定效率具有极高的应用价值。例如,可以在引入目的突变的同时引入限制性内切酶识别位点,从而间接识别阳性克隆。然而,大多数基因无法在引入限制性内切酶识别位点的同时保持所编码的氨基酸不变,从而极大地限制了该方法的应用。

泳道1、3、5、7、9使用HCT116 c-Jun野生型细胞基因组DNA为模板,泳道2、4、6、8、10为HCT116 c-Jun P244A敲入突变细胞基因组DNA为模板;第1、2和9、10泳道使用YEASEN和Vazyme的普通Taq酶,第3～8泳道分别使用YEASEN、Vazyme和TOYOBO的高保真DNA聚合酶

本研究借鉴了疾病诊断中常用的基于PCR反应的突变检测方法,并进行了针对性的优化,来快速筛选带有目的突变的阳性克隆。本研究中首先使用克隆在质粒上的含有定点突变的VRK1、BubR1和Cdc20基因来检测该方法能否有效鉴定细胞外突变。VRK1参与包括细胞周期的起始、G2/M期的染色质浓缩、高尔基体断裂和有丝分裂中的核膜组装等多个过程,多种肿瘤中均能够检测到其过度表达[9-11］。BubR1和Cdc20是介导纺锤体组装检查点激活的关键成分,在哺乳动物中高度保守,其表达水平与纺锤体组装检查点功能之间存在剂量依赖性效应[12-15］。本研究在引物的3′端分别设计了与突变序列相匹配的第1、2、3个碱基,菌落PCR结果显示该方法可有效扩增携带有突变型的质粒,而野生型无PCR产物。

本研究进一步使用了HDAC1 Y87F和c-JunP244A敲入突变细胞系以验证该方法检测基因组DNA敲入突变的效率。HDAC1基因编码的蛋白质属于组蛋白脱乙酰酶家族,在真核基因表达的调控中起着关键作用[16-17］。c-Jun参与包括细胞增殖、凋亡、存活、肿瘤发生和组织形态发生等多种细胞活动。有研究表明细胞外信号可以诱导c-Jun的翻译后修饰,从而导致转录活性和靶基因表达的改变[18-20］。为了保护供体DNA不会被Cas9内切酶重复切割,在不改变编码氨基酸的情况下,分别对模板DNA上的PAM序列进行了同义突变(TCG→AGT,TC→AG)。结果显示,在引物的3′端引入与突变序列相匹配碱基可有效区分亲本和敲入突变基因组。

以上结果证实无论是细胞内还是细胞外突变,该方法只需要增加一步菌落PCR或者基因组PCR即可成功筛选阳性克隆,对一个或几个阳性克隆进行测序即可获得所需的突变体,显著地提高了突变体筛选的效率。本研究还进一步优化了PCR的退火温度,引入额外的突变位点增加该方法的特异性,并考察了不同DNA聚合酶的应用效果。

基于本研究的结果,为提高该方法的扩增效率和特异性,我们提出以下建议:①使用普通的Taq酶。②尽量使用3′端含有2或3个甚至更多的与突变序列匹配的引物进行克隆的快速筛选。如果只能使用含有1个突变核苷酸的引物,则可通过提高退火温度或在引物3′端的倒数第2至第4个核苷酸中的任意一个位点引入单个突变碱基,以减少假阳性的产生。③在使用CRISPR/Cas9进行敲入突变时,需要将DNA模板的PAM位点进行突变来避免模板被Cas9识别切割。我们建议在设计引物时将突变后的PAM位点的DNA序列也引入引物中,从而提高筛选的特异性。④需要注意的是,该方法仅适合于敲入细胞系的筛选。对于CRISPR/Cas9介导的基因敲除,由于基因敲除结果不可预测,无法使用该方法来筛选基因敲除细胞。

综上所述,本研究建立并且优化了一种通过一步PCR就能够快速地筛选出体外定点突变体或者CRISPR/cas9介导的敲入突变体的方法,简化了突变体的鉴定过程,有效降低了实验成本,提高了工作效率。

作者声明：宋春林、张刚、王颖参与了研究设计;宋春林、张雨晴、翟玉静完成了实验操作和数据整理;宋春林、张刚、王颖完成了数据分析和论文的写作;宋春林、张雨晴、翟玉静完成了论文的校对。所有作者均阅读并同意发表该论文。所有作者均声明不存在利益冲突。