仑伐替尼对肝细胞癌组织中肿瘤相关成纤维细胞自噬和迁移的影响

赵梓吟 何明阳 韩冰 关鸽 蔡金贞 张斌

(青岛大学附属医院,山东 青岛 266100 1 器官移植中心; 2 肝胆胰外科)

全球范围内肝癌的发病率及死亡率呈现持续上升趋势,其中肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常见的肝癌类型,其发病率约占原发性肝脏恶性肿瘤的75%,确诊以后5年的生存率仅约为18%[1-2]。尽管手术切除、射频消融和经动脉化疗栓塞等治疗方案改善了无转移HCC患者的预后,但多数HCC患者确诊时已经是中晚期,对于无法手术的中晚期HCC患者,往往只能采取保守方案治疗[3]。目前治疗HCC的一线药物包括阿替利珠单抗+贝伐珠单抗、多纳非尼、仑伐替尼、索拉菲尼等,其中仑伐替尼作为多靶点的酪氨酸激酶抑制剂,适用于不可切除的肝功能为Child-Pugh A级的晚期HCC患者[4-6]。

近年来,对于肿瘤发展机制和治疗方法的研究探索重心逐渐从肿瘤本身转向其所处的肿瘤微环境(TME)[7-8],TME中基质细胞具有遗传稳定性,可有效降低肿瘤耐药和复发风险[9-11]。肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)是激活的成纤维细胞,作为TME中最主要的基质细胞成分以及细胞外基质的关键来源[12],CAFs在促进肿瘤进展和转移中有关键作用,目前已经成为潜在肿瘤治疗靶点[13-15]。研究发现,仑伐替尼可通过作用于肿瘤的多个靶点达到抑癌的作用,比如可靶向阻断肿瘤的血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)途径抑制肿瘤血管生成,可通过使肿瘤细胞饥饿和缺氧抑制肿瘤细胞生长致死亡,但仑伐替尼能否影响CAFs的生物学行为尚无相关研究报道。本研究拟探究仑伐替尼对CAFs生物学功能的影响及其机制,旨在为HCC患者的个性化治疗提供理论依据,同时为靶向TME的治疗方式提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

收集于青岛大学附属医院肝胆胰外科确诊为HCC的3例患者的肿瘤组织以及癌旁正常组织标本用于原代CAFs分离培养。胶原酶、青链霉素购买于美国 Sigma公司;α-SMA抗体购买于美国cst公司,仑伐替尼购买于美国MCE公司;NEBNext UltraTM RNA文库准备试剂盒购于美国Illumina公司。JEM-1200EX透射电镜购于日本JEOL公司,超薄切片机购买于美国Ultracute公司,光学显微镜购于日本尼康公司。

1.2 CAFs的分离、纯化、培养及分组

取3例患者的癌组织以及癌旁正常组织,用含10 g/L青链霉素的PBS溶液4 ℃下清洗2次,剪碎组织后,置于10 mL含体积分数0.10胎牛血清以及体积分数0.001的Ⅳ型胶原酶溶液中,37 ℃下恒温摇床中消化30 min。将消化液用200目滤网过滤,670 r/min离心5 min,弃上清液后再漂洗2次,使用红细胞裂解液去除红细胞后,置于完全培养基(含体积分数0.10的胎牛血清及10 g/L青链霉素的DMEM高糖型培养基)中继续培养,3 d后更换新的完全培养基。在含有100 μg/L碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的完全培养基中采用自然传代法对CAFs进行纯化,获得原代CAFs细胞。再将原代CAFs细胞重新培养于完全培养基中,置于37 ℃、含体积分数0.05 CO2的恒温培养箱中常规培养。待CAFs传代3次且细胞融合度达80%～90%时,分别于培养基中加入46 nmol/L的仑伐替尼和等体积的DMSO,分为仑伐替尼组和DMSO组,继续培养72 h用于后续实验。

1.3 CAFs的免疫荧光检测

将培养72 h的DMSO组和仑伐替尼组CAFs接种于铺有细胞爬片的24孔板中,在37 ℃、含体积分数0.05的CO2培养箱中继续培养24 h,PBS清洗3次,40 g/L多聚甲醛固定30 min。再以PBS配置的体积分数0.003的曲拉通溶液常温渗透15 min,PBS配置的体积分数0.05山羊血清常温封闭1 h,α-SMA一抗孵育过夜后,加入FITC二抗室温孵育2 h,DAPI复染7 min,PBS清洗后滴加甘油封片。使用激光共聚焦显微镜拍照并观察两组细胞中的α-SMA荧光强度。

1.4 CAFs的转录组学测序及富集分析

委托上海吉凯基因医学科技股份有限公司对培养72 h的DMSO组和仑伐替尼组的CAFs进行转录组学测序,每组设3个重复样本。根据基因表达分析结果筛选两组间差异表达的基因(P<0.05),并对差异表达基因进行GO功能富集分析(http://geneontology.org)以及KEGG信号通路富集分析(https://www.genome.jp/kegg/pathway.html)。

1.5 仑伐替尼在CAFs上的药物靶点组学测序及富集分析

委托上海中科新生命生物科技有限公司对培养72 h的DMSO组和仑伐替尼组的CAFs进行药物靶点组学测序。通过质谱分析对肽段酶切产物进行序列鉴定和数据非依赖性采集(DIA)蛋白质组学定量分析,确定仑伐替尼在CAFs上结合的靶蛋白及序列,并对靶蛋白进行GO功能富集分析和KEGG信号通路富集分析。

1.6 CAFs的透射电镜扫描

将培养72 h的DMSO组和仑伐替尼组CAFs接种于铺有细胞爬片的24孔板中,在37 ℃、含体积分数0.05的CO2培养箱中继续培养24 h,然后4 ℃下以体积分数0.025的戊二醛固定4 h。用PBS缓冲液冲洗细胞3次,每次10 min,再用4 ℃体积分数为0.01的锇酸固定细胞2 h,用PBS缓冲液冲洗3次,每次10 min。用体积分数0.3、0.5、0.7、0.8、1.0的梯度乙醇对两组细胞依次脱水,每次10 min。之后Epon812环氧树脂包埋样本,依次以37、45、65 ℃温箱固化,每级温度下24 h。半薄切片定位后用超薄切片机切片,醋酸双氧铀硝酸铅染色,最后使用透射电镜观察。

1.7 CAFs的Transwell实验

将培养72 h后的DMSO组和仑伐替尼组的CAFs更换为无血清DMEM培养基,继续培养24 h后,接种于无血清DMEM培养基的Transwell上室(8 μm/孔)中,在37 ℃、含体积分数0.05的CO2培养箱中继续培养24 h,室温下对迁移至下室的细胞用0.5%结晶紫染色20 min。使用光学显微镜对染色细胞进行拍照,对迁移CAFs进行计数。

1.8 CAFs划痕实验

将培养72 h的DMSO组和仑伐替尼组的细胞平铺在6孔板中,待CAFs融合度达90%以上时,使用200 μL滤芯吸头尖端在6孔板上划痕。划痕后将原培养基立即更换为含体积分数0.02胎牛血清的低血清培养基,用电子显微镜拍摄划痕区域,分别于划痕后0、24 h时采集图像,并计算伤口愈合百分比,计算公式为:伤口愈合百分比=(0 h划痕宽度-24 h划痕宽度)/0 h划痕宽度。

1.9 统计学处理

2 结 果

2.1 CAFs转录组学的测序结果及其GO功能及KEGG信号通路富集分析结果

免疫荧光染色结果显示,CAFs标志物α-SMA染色阳性率>90%(图1),图中红色为α-SMA染色的CAFs,蓝色为DAPI染色的细胞核,提示分离培养培养成功,可用于后续实验。转录组学测序结果示,与DMSO组进行比较,仑伐替尼组CAFs共有2 054个基因显著上调,2 109个基因显著下调(P<0.05);GO功能富集分析显示,差异基因与细胞迁移调节、成纤维细胞迁移、自噬体、溶酶体等功能密切相关;KEGG信号通路富集分析显示,差异基因参与的通路主要有溶酶体相关通路、PI3K-AKT通路、动物自噬相关通路、癌症相关通路、肝细胞癌相关通路等。

2.2 CAFs药物靶点组学的测序结果及其富集分析

对CAFs药物靶点组学测序结果中筛选出的P<0.05的差异肽段进行GO功能及KEGG信号通路富集分析,显示显著富集的差异肽段与细胞迁移、细胞动力、细胞骨架、溶酶体等相关,差异基因参与的通路主要有细胞骨架调节、肝细胞癌、细胞凋亡、PI3K-AKT通路、癌症相关通路等。

2.3 仑伐替尼对CAFs自噬及迁移的影响

透射电镜扫描结果显示,DMSO组和仑伐替尼组CAFs中自噬小体(黄色箭头所示)数目分别为2.00±1.00、7.67±1.53,两组相比较差异显著(t=5.38,P<0.05),见图2。Transwell实验结果显示,DMSO组和仑伐替尼组中CAFs迁移数目分别为60.00±5.00、26.67±2.52,两组比较差异有显著性(t=10.31,P<0.05),见图3。划痕实验结果显示,DMSO组和仑伐替尼组迁移的CAFs伤口愈合百分比分别为58.00±4.00、21.00±2.00,两组比较差异有显著性(t=14.33,P<0.05)。

A:DMSO组,B:仑伐替尼组;结晶紫染色,10倍

3 讨 论

HCC的高复发率和转移率导致HCC患者的长期存活率不理想[1-2]。因此,进一步探究肝癌的转移机制及探究新的治疗策略,对于延长肝癌患者生存时间至关重要[16-17]。肝癌的转移不仅需要肝癌细胞逃避凋亡信号及宿主免疫反应,还需要TME中细胞间通讯支持,因此目前对于肿瘤发病机制和治疗方法的探索重心也逐渐从肿瘤本身转向其所处微环境,靶向TME的治疗方式被寄予厚望,主要有以下几方面原因:肿瘤微环境中的其他细胞具有遗传稳定性,比易发生基因突变的肿瘤细胞更容易靶向治疗寻找靶点[18];不同于肿瘤细胞的获得性耐药,靶向肿瘤微环境的治疗可有效减少耐药风险和肿瘤复发。

CAFs是激活的成纤维细胞,是TME中最主要的基质细胞成分以及细胞外基质(ECM)的关键来源,在促进肿瘤进展和转移中具有关键作用,并且也是潜在的肿瘤治疗靶点。目前,针对靶向CAFs的治疗策略研究主要集中为以下3个方面:通过靶向特异性表面标志物(如成纤维细胞活化蛋白FAP)去除CAFs、靶向CAF的下游效应器和信号通路、将促肿瘤性CAF的激活状态恢复为相对静止状态或肿瘤抑制型。

仑伐替尼可以通过靶向阻断VEGFR2途径抑制肿瘤血管生成,使肿瘤细胞饥饿和缺氧,从而导致其严重生长迟缓甚至死亡。仑伐替尼还可以作用于HCC本身及其TME内多种细胞的多个靶点[19]。目前仑伐替尼对肝癌细胞的直接作用机制研究较为成熟,但尚未见仑伐替尼对CAFs的生物学行为影响的研究。

为探索仑伐替尼对CAFs生物学行为的影响,本研究首先分离培养了原代CAFs,通过免疫荧光染色的方法鉴定CAFs的标志物,即平滑肌肌动蛋白α-SMA,结果显示,本研究培养的原代CAFs中α-SMA免疫荧光染色阳性率>90%,可以用于后续细胞实验。

通过转录组学测序和药物靶点组学测序,本研究发现DMSO组和仑伐替尼组的CAFs之间的差异基因和差异肽段主要富集在细胞迁移、自噬等相关功能和通路上,提示仑伐替尼可能主要通过影响CAFs的自噬以及迁移的能力,进一步影响HCC的进展。自噬是一种细胞组分被运送到溶酶体进行降解的过程,以保持细胞成分的基础周转,同时提供能量和大分子前体[20]。到目前为止,关于自噬在肿瘤进展和抑制中的双重作用仍然存在着争议,自噬在肿瘤发展的不同阶段中起着动态的促癌或者抑癌的作用[21]。对自噬的调控可以作为肿瘤治疗的有效介入策略。本研究结果显示仑伐替尼与CAFs自噬相关,并且可能通过这一途径抑制了CAFs的促癌作用。

本研究同时通过透射电镜观察CAFs,以验证仑伐替尼对CAFs自噬的诱导作用,transwell和细胞划痕实验结果均显示,仑伐替尼对CAFs迁移具有抑制作用。根据已有研究报道,CAFs可通过化学途径调节血管生成、基质重塑,分泌能促进肿瘤生长和抑制肿瘤免疫的细胞因子、趋化因子、炎症因子和生长因子,并促进肿瘤细胞的上皮-间充质转化(EMT)和干细胞特性(CSCs),从而促进肿瘤的侵袭转移[22-24]。除此之外,CAFs还可以通过机械力的作用,以物理方式对肿瘤起到协同转移作用[25]。结合本研究的结果,提示仑伐替尼除了直接作用于肿瘤细胞外,也可以通过作用于CAFs间接抑制肿瘤进展。

综上所述,本研究首次对于仑伐替尼处理过的CAFs进行转录组学测序和药物靶点组学测序,首次发现了仑伐替尼可诱导CAFs自噬,并抑制其迁移。本研究不仅验证了靶向药物仑伐替尼除了对肿瘤细胞本身的作用之外,而其对TME的作用也为CAFs靶向治疗提供了新思路。未来应进一步探索CAFs的特异性靶点及作用机制,为HCC的治疗探索新的方向。

伦理批准和知情同意：本研究涉及的所有试验均已通过青岛大学附属医院医学伦理委员会的审核批准(文件号QYFYWZLL27592)。所有试验过程均遵照《赫尔辛基宣言》(1996版)和中国有关临床试验研究规范、法规进行。受试对象或其亲属已经签署知情同意书。

作者声明：赵梓吟、张斌、韩冰参与了研究设计;赵梓吟、何明阳、关鸽、蔡金贞参与了论文的写作和修改。所有作者均阅读并同意发表该论文。所有作者均声明不存在利益冲突。