SCAMP2在结直肠癌中的表达及其意义

乔业华 郭栋 王璐 曲婷婷 张翔雁 邢晓明

(1 青岛大学基础医学院病理学系,山东 青岛 266071; 2 青岛大学附属医院胃肠外科; 3 青岛大学附属医院病理科)

目前,结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是世界上人群中发病率、致死率位列前3位的恶性肿瘤[1］。随着医疗技术的提高,临床上多采用化疗联合放疗和免疫疗法,以提高治疗效果,但是仍有部分患者治疗后出现复发或转移,严重影响患者的生活质量,因此寻找更有效的CRC治疗的靶点尤为重要。分泌载体膜蛋白(SCAMPs)是具有4个跨膜结构的载体蛋白,参与高尔基体与后高尔基体循环的转运,SCAMPs保守蛋白包括SCAMP1～SCAMP5 5个亚型[2-3］。目前关于SCAMP2的研究主要限于其在囊泡转运、胞吞胞吐中的作用。而且研究发现,与癌旁正常组织相比较,SCAMP2在胰腺癌肿瘤组织以及血液系统肿瘤之中高表达[4-5］,但尚未有研究揭示SCAMP2在CRC组织中的表达情况。本研究通过免疫组织化学法检测SCAMP2在CRC中的表达水平,并且通过临床病理分析探讨SCAMP2在CRC发生发展中的意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2014年1月—2016年8月青岛大学附属医院309例原发性CRC患者术中的CRC组织和癌旁正常组织标本,纳入标准为术前未行放、化疗者。同时收集患者的年龄、性别、淋巴结转移情况以及肿瘤分化程度、大小、TNM分期、浸润程度、微卫星不稳定性(MSI)、KRAS和NRAS突变情况等一般临床资料。电话随访患者生存时间、生存状态等信息,随访截至2022年12月3日。

1.2 方法

1.2.1组织芯片的制备及免疫组织化学染色 将309例石蜡包埋的CRC组织和癌旁正常组织标本,使用组织仪分别制备成2.0 mm孔径、4 μm厚的组织芯片。将CRC以及癌旁正常组织的芯片依次放入盛有二甲苯、梯度乙醇的玻璃缸中脱蜡、水化,之后放入柠檬酸钠抗原修复液中,加热至100 ℃后持续2 min,冷却至室温,置于30 g/L过氧化氢溶液中浸泡20 min后,滴加山羊血清于取出的组织芯片上,室温下反应30 min。然后滴加SCAMP2一抗稀释液(1∶800,北京中杉金桥生物科技有限公司,TA506991,OTI3C2)于组织芯片上,同时将仅滴加抗体稀释液的组织芯片(北京中杉金桥生物科技有限公司,ZLI-9029)作为阴性对照,4 ℃过夜。滴加通用型二抗(北京中杉金桥生物科技有限公司)至组织芯片中并室温反应2 h,滴加DAB显色液,苏木素溶液复染,氨水分化后脱水,滴加中性树胶封片,置于光学显微镜下对染色结果进行评分。

1.2.2免疫组织化学染色结果判读 由2名病理医师随机选择至少5个高倍视野评价SCAMP2染色情况,选取的高倍视野染色情况存在差异时则以占比多的染色结果为准,2位医师结果不同时由第三名病理医师重新进行评分。SCAMP2阳性评定标准为细胞核或细胞浆染色为棕黄色。染色强度评分标准:0分为无着色,1分为淡黄色,2分为棕黄色,3分为棕褐色。以染色强度≥2分为SCAMP2高表达,以染色强度<2分为SCAMP2低表达[6］。

1.3 统计学处理

采用SPSS 23.0软件对数据进行统计学处理。SCAMP2在CRC组织与癌旁正常组织中的表达评分比较采用t检验,与临床病理特征的关系分析采用Pearsonχ2检验;生存分析采用Log rank检验以及Kaplan-Meier法,采用Graphpad Prism 7软件绘制生存曲线。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 两种组织中SCAMP2表达水平比较

免疫组织化学染色结果显示,SCAMP2在癌旁正常组织中呈高表达,在CRC组织中呈低表达(图1)。309例CRC组织中SCAMP2高表达者120例,低表达者189例;309例癌旁正常组织样本中SCAMP2呈高表达者232例,低表达者77例,CRC组织及癌旁正常组织中SCAMP2的表达水平差异具有显著性(t=5.042,P<0.05)。

2.2 SCAMP2与CRC患者临床病理特征的关系

SCAMP2表达水平与患者肿瘤大小、MSI有关(χ2=6.953、4.923,P<0.05),而与年龄、性别、分化程度、淋巴结是否有转移、TNM分期、浸润程度、KRAS及NRAS突变情况无相关性(P>0.05)。见表1。

A:癌旁正常组织,B:CRC组织,200倍

表1 SCAMP2表达水平与患者临床病理特征的关系[例］

2.3 SCAMP2表达与CRC患者预后的关系

依据SCAMP2在CRC组织中的表达水平情况,将所有患者分为SCAMP2高表达组120例和SCAMP2低表达组189例,Kaplan-Meier生存分析显示,SCAMP2高表达组与低表达组患者的总体生存期分别为(91.481±3.634)、(81.312±2.145)月;SCAMP2高表达组与低表达组患者的无病生存期分别为(34.792±0.708)、(35.860±0.487)月,两组患者的上述两个指标比较,差异均无显著统计学意义(P>0.05)。

3 讨 论

CRC是临床上常见的恶性肿瘤,多由腺瘤发展而来[7-9］。尽管诊断、治疗CRC的技术不断提高,但部分患者的治疗效果仍不理想,常规治疗难以改善患者预后[10-13］。因此探索CRC发生发展的分子机制,寻找相关的分子标记物在临床上具有重要意义。SCAMPs家族共享四个疏水跨膜结构域(TMD1～4),N端由TMD1连接,高度保守的亲水性E肽序列的两端为TMD2与TMD3[14］。SCAMPs蛋白主要参与细胞膜转运、内吞作用以及囊泡循环[15-17］。最近有研究显示,SCAMP家族的表达水平及其变化会影响肿瘤的发生发展。YANG等[18］研究表明SCAMP1可以促进胆囊癌与胰腺癌细胞迁移与侵袭。VENUGOPALAN等[19］研究显示,SCAMP3或可作为肺腺癌进展的负性调节因子。GE等[20］研究表明,原发性胶质瘤SCAMP4的低表达与患者的良好预后显著相关,提示SCAMP4是肿瘤潜在的癌基因。MAO等[4］研究表明,SCAMP1、SCAMP5在胰腺癌中高表达,且具有作为诊断、预后因子的潜在临床价值。上述研究提示,SCAMP家族蛋白在调节肿瘤的增殖、转移等恶性表型方面发挥重要作用,但SCAMP2作为SCAMP家族中的关键蛋白在肿瘤中的研究较少,其作用机制也尚不明确。本研究通过免疫组织化学法检测SCAMP2在CRC中的表达水平,探讨其与CRC发生发展的关系。

SCAMP2的结构主要为4个高度保守的跨膜区域以及多个N端NPF重复的序列,EH结构域蛋白与NPF相互作用,进行囊泡的转运[15］。BLONDEAU等[21］研究发现SCAMPs与参与物质运输的网格蛋白共定位,提示SCAMP2同样参与了细胞内物质转运过程。本研究的免疫组织化学染色结果显示,SCAMP2在细胞质以及细胞间质中均有分布,这可能与其转运功能相关;同时病理特征分析结果表明SCAMP2的表达与肿瘤体积具有相关性,SCAMP2在CRC中低表达,且SCAMP2低表达患者肿瘤体积较大,提示SCAMP2可能与CRC的发生有关系,但还需进一步明确其在CRC中的具体作用机制。本研究显示SCAMP2的表达水平与患者的年龄、性别、淋巴结转移情况以及肿瘤分化程度、TNM分期、浸润程度、KRAS和NRAS突变情况无明显相关性,分析原因可能与本研究选用的标本全为CRC与癌旁正常组织,因此制作成的组织芯片中阳性细胞占比为100%。可见仅仅以染色强度作为唯一标准进行评价,SCAMP2表达水平与淋巴结转移、肿瘤TNM分期等指标没有表现出明显的相关性。

中国CRC诊疗规范推荐将MSI以及KRAS、NRAS基因的筛查结果作为临床上CRC复发、转移和免疫用药等的参考依据,因此,研究SCAMP2表达水平与MSI、KRAS和NRAS基因间的关系,探讨SCAMP2的表达水平能否作为CRC复发以及用药的参考依据,还是具有比较重要的临床实际意义[22］。微卫星高度不稳定多发于Lynch综合征患者,并且是CRCⅡ期患者预后良好的指标及氟尿嘧啶耐药的靶点[23］。本研究结果显示SCAMP2在CRC组织中高表达与存在MSI有关系,因此推测SCAMP2也可能是检测Lynch综合征的指标以及氟尿嘧啶化疗耐药的靶点。YUE等[5］研究发现,与健康人群相比较,急性髓系白血病患者的外周血中SCAMP2 mRNA的表达水平相对较高,且急性髓系白血病患者预后不良与SCAMP2 mRNA的高水平表达相关,提示SCAMP2是急性髓系白血病的潜在致病基因。MAO等[4］研究还发现,SCAMP1～SCAMP4在胰腺癌组织中的表达高于正常组织,但SCAMP2高表达与胰腺癌患者预后不良无关,这与本研究中SCAMP2在CRC组织中低表达结论相反,由此推测SCAMP2在不同组织器官中的表达水平可能与组织的生物学特性有关,即使是同一种蛋白在不同肿瘤组织的功能也会不同,如SCAMP3在肺腺癌组织中低表达,发挥抑癌因子的作用;而在胰腺癌组织中高表达,发挥促癌因子的作用。

综上所述,SCAMP2在CRC组织中低表达,可能与CRC的发生发展具有相关性,其高表达可能与CRC肿瘤大小、MSI有关。但SCAMP2在CRC中发挥作用的分子机制还需进一步探讨,SCAMP2能否作为早期诊断CRC的生物标志物尚待明确。

伦理批准和知情同意：本研究涉及的所有试验均已通过青岛大学附属医院医学伦理委员会的审核批准(文件号QYFYWZLL27662)。所有试验过程均遵照《全国临床检验操作规程》的条例进行。受试对象或其亲属已经签署知情同意书。

作者声明：乔业华、郭栋、王璐、曲婷婷参与了研究设计;乔业华、张翔雁、邢晓明参与了论文的写作和修改。所有作者均阅读并同意发表该论文。所有作者均声明不存在利益冲突。