ADSCs-CM对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞神经保护作用及其机制

肖欢欢 尹侃 肖雨 张峥 侯琳

(1 青岛大学基础医学院生物化学与分子生物学系,山东 青岛 266071;2 青岛微能生命科技集团有限公司; 3 滨州医学院第二临床医学院)

帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是一种常见的进行性神经退行性疾病,其主要原因是黑质中多巴胺能神经元的选择性死亡,目前的治疗方法主要是通过左旋多巴(一种多巴胺前体)增强正常运动所需的多巴胺能信号来改善症状[1],但是长期使用会使药物敏感性降低。至今尚没有可以减缓疾病进展或防止神经变性的有效方法,临床迫切需要寻找治疗PD新的靶点和生物标志物。

间充质干细胞(MSCs)条件培养基(CM)对PD有刺激神经发生和减少神经炎症的作用,但是具体作用机制还不是很明确。以前针对MSCs的研究多是使用骨髓MSCs(BM-MSCs)[2],目前可从脂肪组织[3]、牙髓[4]、子宫内膜[5]、皮肤[6]、羊水[7]、胎盘[8]和脐带血[9]中分离获取。由于皮下脂肪组织丰富,易于获取,并且具有最低限度的伦理考虑[10],因此,在各类的成体干细胞中,使用人脂肪间充质干细胞(ADSCs)的研究越来越多[11]。本研究通过1-甲基-4-苯基吡啶(MPP+)诱导SH-SY5Y细胞损伤来模拟环境毒素导致的神经元损伤,探讨ADSCs-CM对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞线粒体功能的影响及其作用机制,为进一步寻找PD治疗靶点和开发PD的新治疗策略奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 细胞和试剂

人神经母细胞瘤细胞系(SH-SY5Y)购自美国细胞培养物收藏中心(ATCC),ADSCs-CM由青岛大学基础医学院干细胞再生医学研究院提供。二辛可宁酸测定(BCA)试剂盒、线粒体复合物Ⅰ(CⅠ)活性测定试剂盒购买于北京索莱宝科技有限公司,MPP+(德国Sigma公司),JC-1试剂盒(上海爱必信生物科技有限公司),活性氧(ROS)检测试剂盒、三磷酸腺苷(ATP)测定试剂盒线、粒体提取试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司),兔抗人LC3/P62(英国Abcam公司)。

1.2 细胞的处理和分组

将SH-SY5Y细胞于含体积分数0.10胎牛血清和体积分数0.01青链霉素的DMEM高糖培养基中,置于37 ℃、含体积分数0.05 CO2的培养箱中常规培养,隔天更换一次培养基,每2～3 d传代一次。将生长密度达到70%～80%的SH-SY5Y细胞分为Ctrl组、PD组和CM组,Ctrl组于完全培养基中常规培养,PD组在完全培养基中加入1.0 mmol/L的MPP+以构建PD细胞模型[12],将CM组置于含有1.0 mmol/L MPP+的ADSCs-CM中进行培养,均培养24 h。

1.3 研究方法

1.3.12,7-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)荧光方法检测SH-SY5Y细胞中ROS的含量 取处理24 h的各组SH-SY5Y细胞,去除原有的细胞培养液后,加入1 mL用基础培养基稀释的终浓度为10 μmol/L的DCFH-DA,37 ℃下孵育20 min,然后用无血清细胞培养基冲洗细胞3次,完全去除细胞表面的DCFH-DA,通过荧光显微镜观察绿色荧光强度。

1.3.2ATP测定试剂盒测定SH-SY5Y细胞中ATP总量 取处理24 h的各组SH-SY5Y细胞,严格按照ATP测定试剂盒测定方法操作,并使用具有检测化学发光功能的多功能酶标仪来测定各组SH-SY5Y细胞中ATP总量。

1.3.3各组SH-SY5Y细胞中线粒体CⅠ酶活性的测定 取处理24 h的各组SH-SY5Y细胞,严格按照线粒体提取试剂盒的提取方法提取线粒体蛋白,然后于线粒体蛋白中加入提取缓冲液,按照线粒体CⅠ活性测定试剂盒的操作要求,测定线粒体CⅠ的活性。

1.3.4单丹磺酰尸胺(MDC)荧光法观察细胞自噬在处理24 h的各组SH-SY5Y细胞的6孔板中,每孔加入1 mL MDC染色液,置于37 ℃的恒温培养箱当中避光孵育30 min。吸弃MDC染色液并使用1 mL Assay Buffer洗涤3次。最后在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光。

1.3.5Western blot实验检测SH-SY5Y细胞中P62、LC3蛋白相对表达量 在处理24 h的各组SH-SY5Y细胞中加入含有1 mmol/L苯甲烷磺酰氟的缓冲液(RIPA),采用放射免疫沉淀法提取细胞中总蛋白,并用BCA蛋白分析试剂盒对提取的蛋白进行定量。将等量的蛋白样品(30 μg)用体积分数0.10的SDS-PAGE分离胶,转移到PVDF上,室温下用体积分数0.05的牛血清白蛋白(BSA)封闭3 h后,与一抗4 ℃孵育过夜。然后将二抗(1∶5 000)在室温下孵育1 h。使用增强化学发光试剂显现反应条带,使用ImageG-Pro Plus6软件分析目的蛋白条带P62、LC3和内参蛋白条带GAPDH的灰度值,将目的蛋白条带的灰度值与内参蛋白条带的灰度值进行比较,得出目的蛋白的相对表达量。

2 结 果

2.1 各组SH-SY5Y细胞内ROS含量比较

Ctrl组、PD组、CM组SH-SY5Y细胞ROS含量分别为1.00±0.00、2.23±0.41、0.74±0.06,组间比较差异显著(F=33.46,P<0.05)。其中,PD组与Ctrl组、CM组与PD组细胞中ROS含量比较差异均有显著性(tLSD=5.21、6.26,P<0.05),Ctrl组与CM组细胞中ROS含量比较差异无显著性(P>0.05)。见图1。

2.2 各组SH-SY5Y细胞中ATP总量比较

Ctrl组、PD组、CM组SH-SY5Y中ATP总量分别为0.24±0.04、0.13±0.02、0.27±0.06,组间比较差异有显著性(F=8.79,P<0.05)。其中,PD组与Ctrl组、CM组与PD组细胞的ATP总量比较差异均有显著性(tLSD=4.00、4.02,P<0.05),Ctrl组与CM组细胞的ATP总量比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3 各组SH-SY5Y细胞中线粒体CⅠ活性的比较

Ctrl组、PD组、CM组SH-SY5Y细胞中线粒体CⅠ的活性分别为19.40±1.14、10.85±3.06、18.92±3.06,组间比较差异有显著意义(F=10.36,P<0.05)。其中,PD组与Ctrl组,CM组与PD组细胞线粒体CⅠ活性比较差异均有显著意义(tLSD=4.53、3.23,P<0.05),Ctrl组与CM组细胞线粒体CⅠ活性比较差异无显著性(P>0.05)。

2.4 各组SH-SY5Y细胞自噬水平的比较

MDC荧光染色法观察各组SH-SY5Y细胞自噬情况,Ctrl组、PD组、CM组细胞自噬率分别为1.00±0.00、0.44±0.08、1.33±0.31,三组间比较有显著差异(F=18.21,P<0.05)。其中,PD组与Ctrl组、CM组与PD组比较差异均具有显著意义(tLSD=12.61、4.88,P<0.05),Ctrl组较CM组细胞自噬率比较差异无显著性(P>0.05)。见图2。

图1 各组SH-SY5Y细胞中ROS含量(DCFH-DA染色,400倍)

2.5 各组SH-SY5Y细胞中P62、LC3蛋白相对表达量比较

Western blot结果显示,Ctrl组、PD组、CM组SH-SY5Y细胞中P62蛋白相对表达水平为1.00±0.00、1.26±0.05、1.10±0.05,LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白相对表达水平为1.00±0.00、0.78±0.09、1.11±0.05,组间比较差异有显著性(F=28.61、28.61,P<0.05);PD组与Ctrl组细胞中P62、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白相对表达量比较差异均有显著性(tLSD=8.78、4.47,P<0.05),CM组与PD组细胞中P62、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白相对表达量比较差异均有显著意义(tLSD=3.80、5.96,P<0.05),Ctrl组与CM组细胞中P62、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白相对表达量比较差异无显著性(P>0.05)。见图3。

3 讨 论

PD作为一种神经退行性疾病,影响着世界上数百万人的身体健康和正常生活。PD潜在的发病机制和切实有效的治愈方法至今仍不明确,目前的治疗方法也只能缓解患者运动障碍等症状,但不能阻止PD进展,也不能延长多巴胺能神经元存活时间。

图3 各组SH-SY5Y细胞中P62、LC3蛋白表达水平

干细胞移植已经成为治疗PD等神经退行性疾病的一项非常有效的方法。最近的证据表明,干细胞移植的治疗机制不是因为其具有直接分化能力,而是因为其分泌的生物活性分子发挥了相应的作用。MSCs来源的分泌体系在为受损的组织提供再生微环境的同时[13],还可以避免干细胞移植的副作用[14-15]。目前干细胞移植中存在的问题主要有移植细胞分化差、植入率和成活率低、有可能激活异体免疫排斥等[16]。干细胞所分泌的生物活性分子可以提供一个再生微环境,缩减损伤区域,建立一个自我调节的再生反应体系[17-18]。研究显示,MSCs-CM对PD有刺激神经发生和减少神经炎症的作用。尽管MSCs-CM有神经保护作用,但其仍然有其治疗的局限性[17-18]。

线粒体功能障碍引起的神经元氧化应激在PD的发生中起着至关重要的作用。恢复线粒体功能和抑制氧化应激已成为PD受损神经元修复的关键疗法。本研究通过DCFH-DA染色方法对各组的SH-SY5Y细胞内ROS含量进行比较,研究结果表明,与Ctrl相比,PD组细胞的ROS含量明显升高,与PD相比,CM组细胞的ROS产生量显著降低,提示ADSCs-CM可降低MPP+诱导的SH-SY5Y细胞中ROS的含量。在应激条件下,有缺陷线粒体数量增加,产生大量活性氧,细胞内ROS无法及时清除[19]。线粒体是参与ROS生成的主要的细胞器[20],ROS过量的产生使得细胞的抗氧化效率降低从而导致细胞产生氧化应激,对线粒体产生不利的氧化修饰,这种现象在许多涉及线粒体功能障碍的神经退行性疾病当中均可以观察到[21]。本研究ATP合成测定结果表明,与Ctrl组相比,PD组细胞的ATP总量明显降低,与PD组相比,CM组细胞的ATP总量明显升高,提示在MPP+诱导的SH-SY5Y细胞中,ADSCs-CM促进了ATP的生成。ROS的过度积累会导致线粒体通透性转换孔异常开放,线粒体膜电位下降[22]。线粒体膜电位是ATP合成的驱动力,线粒体膜电位下降会导致细胞内ATP总量降低。本研究线粒体CⅠ活性测定结果表明,与Ctrl组相比,PD组细胞的线粒体CⅠ活性明显降低,与PD组相比较,CM组细胞的线粒体CⅠ活性明显升高,提示在MPP+诱导SH-SY5Y中,ADSCs-CM提升了线粒体CⅠ的活性。由于细胞内ATP总量与线粒体CⅠ的活性相关,那么在ATP合成减少的细胞中,线粒体CⅠ活性也是降低的。本研究MDC荧光染色法结果表明,与Ctrl组相比,PD组细胞的自噬率明显降低,而与PD组相比,CM组细胞的自噬率明显升高。Western blot结果表明,PD组与Ctrl组、CM组比较,细胞中P62蛋白相对表达量显著升高、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白相对表达量显著降低。这表明在MPP+诱导的SH-SY5Y细胞中,ADSCs-CM可显著降低细胞自噬水平。自噬作为一个独立的系统,可降解体内受损的蛋白质和细胞器。在正常情况下,自噬处于动态平衡,维持内环境稳态,但在大多数神经退行性疾病中线粒体存在功能受损情况。研究发现,ADSCs-CM可以导致线粒体自噬,从而清除受损线粒体,在氧化应激相关的PD中发挥神经保护作用[23]。

综上所述,本研究旨在通过MPP+作用于SH-SY5Y细胞构建PD细胞模型,检测ROS的产生量以评估MPP+诱导的氧化应激情况,并确定细胞ATP的产生和线粒体CⅠ的活性以评估线粒体功能。通过分析P62和LC3-Ⅱ/Ⅰ表达以及细胞自噬率来评估ADSCs-CM对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞自噬的影响。研究数据表明,MPP+诱导SH-SY5Y细胞线粒体功能障碍,而ADSCs-CM通过线粒体自噬清除受损线粒体,改善MPP+诱导的线粒体ATP合成减少、ROS和氧化应激增加以及线粒体CⅠ活性不足的情况。

总之,本研究表明ADSCs-CM通过线粒体自噬的方式改善MPP+诱导的线粒体功能障碍和体外氧化应激反应,为PD的诊断以及治疗提供了新思路。但是ADSCs-CM靶向调控P62/LC3通路在MPP+诱导的SH-SY5Y细胞中发挥神经保护作用的具体机制还需要进一步研究。

作者声明：肖欢欢、尹侃参与了研究设计;肖雨、张峥、侯琳参与了论文的写作和修改。所有作者均阅读并同意发表该论文。所有作者均声明不存在利益冲突。