miR-663b对IL-1β诱导的髓核细胞炎症反应和凋亡的影响及其机制

李亚雄 马学晓 常胜 魏嘉豪 刘勇

(青岛大学附属医院脊柱外科,山东 青岛 266035)

椎间盘退变(IDD)是引起腰痛的主要原因[1]。炎症反应是IDD发生的重要病理机制。IDD发生初期,髓核组织和纤维环发生局部炎症,这种初级炎症反应有利于组织细胞的自我修复,当炎症的发展失去可控性,内源性细胞持续上调多种促炎因子,如白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等[2],这些因子被认为是激活巨噬细胞炎性小体的上游信号,可阻止巨噬细胞抗炎表型的极化[3]。上述过程导致基质金属蛋白酶激活、生长因子表达下调以及胶原蛋白、多聚糖蛋白降解等一系列级联反应,最终引起髓核细胞(NPCs)的炎症和凋亡,加速椎间盘退变[4]。

IL-1受体1(IL1R1)在不同人类及小鼠细胞类型中表达丰度低,但具有较高亲和性[5]。椎间盘退变期炎性微环境内以IL-1β为主的炎症因子升高,IL-1β与IL1R1结合使其构象发生改变,产生强烈的促炎信号,加速NPCs的凋亡[6]。miRNA是长度约为20～25个核苷酸序列的内源性非编码RNA,通过与靶基因结合,从而抑制靶基因的转录以及翻译[7]。大多数miRNAs在各动物物种中作为关键生物通路和过程的调节器,在进化中起重要作用[8]。miR-663b在肿瘤及炎性相关疾病中研究比较多,有研究发现miR-663b主导的ceRNA调控网络参与了脂多糖诱导的支气管上皮炎症改变的关键调控过程[9]。YU等[10]发现miR-663b在缺氧引起的心肌细胞初期炎症调控中发挥着重要作用。本研究旨在探究miR-663b在减缓NPCs炎症及凋亡中的作用,为IDD临床治疗策略提供新思路。

1 材料与方法

1.1 样本收集

收集2021年9月—2022年5月于我院行椎间孔镜下腰椎间盘切除术的24例IDD患者的椎间盘髓核组织标本。患者男11例,女13例;年龄25～59岁。排除标准:①哺乳期、妊娠期妇女;②合并急、慢性感染疾病者;③合并肿瘤者;④同时患有全身免疫性疾病或其他全身疾病者。

1.2 材料与试剂

F12/DMEM培养基、青/链霉素(1∶1)混合液、Ⅱ型胶原酶购自北京索莱宝有限公司,IL-1β购自美国MCE公司,RNeasyTM试剂盒、逆转录试剂盒、荧光定量扩增试剂盒购自南京诺唯赞有限公司,miRNA-663b mimic、mimic NC购自广州锐博生物科技有限公司,293T细胞购自武汉普诺赛科技有限公司,SDS-PAGE凝胶制备试剂盒购自上海雅酶有限公司,抗IL1R1一抗购自武汉Abclonal生物科技公司,HRP-山羊抗兔二抗购自上海爱必信有限公司,双荧光素酶试剂盒、CCK-8细胞增殖检测试剂盒购自上海翌圣有限公司,TUNEL凋亡检测试剂盒购自武汉伊莱瑞特有限公司。

1.3 细胞分离与培养

将手术取出的髓核组织立即用装有组织保存液的冰盒转移至试验台,PBS冲洗后用组织剪充分剪碎,按照髓核组织体积的3倍加入0.2%Ⅱ型胶原酶溶液37 ℃下在恒温摇床中200 r/min消化4～6 h;采用70 μm细胞滤筛过滤细胞,以800 r/min离心5 min。弃上清液,加入5 mL含0.10 mL胎牛血清和0.01 mL的青霉素/链霉素(1∶1)的DMEM,重悬细胞后转移至培养瓶中,并于37 ℃、含体积分数0.05 CO2的培养箱中继续培养,每3 d换液1次,待NPCs传至第2代,且细胞融合度约90%时用于后续实验。

1.4 NPCs炎症模型构建

将二代NPCs按每孔约5×104个细胞接种至6孔板中,铺板培养24 h,在显微镜下观察细胞的密度为80%左右时,按照0、5、10、20 μg/L浓度梯度加入IL-1β,继续培养24 h后,通过RT-qPCR检测不同IL-1β浓度下NPCs miR-663b的表达情况,以此选择最佳处理浓度。随后按最佳浓度处理NPCs 0、12、24、48 h,再次RT-qPCR检测NPCs中miR-663b表达情况,从而选择最佳处理时间。后续实验均采用该NPCs炎症模型进行。

1.5 NPCs分组及处理

将二代NPCs分为A、B、C、D组,分别按每孔约5×104个细胞接种至6孔板中。其中A组无任何处理,B组仅IL-1β诱导处理,C组IL-1β诱导+miR-663b mimic转染,D组IL-1β诱导+miR-663b mimic NC转染。

1.6 RT-qPCR法检测A～D组NPCs miR-663b转染效率及TNF-α、IL-6、IL-1β、Ⅱ型胶原蛋白、多聚糖蛋白基因的表达水平

使用RNeasyTM试剂盒分别提取A～D组二代NPCs的RNA,加入miR-663b逆转录引物(表1),按照miRNA以及mRNA逆转录试剂盒说明书中要求合成第一链cDNA,随后分别按照miRNA以及mRNA荧光定量扩增试剂盒说明书的要求进行定量扩增,每组分别设置2个复孔。反应体系为:10 μL 的SYBR qPCR-Mix,0.4 μL的10 μmol/L前引物,0.4 μL的10 μmol/L后引物,1 μL模板,7.2 μL ddH2O。反应条件:95 ℃预变性30 s;然后95 ℃ 3 s,60 ℃ 30 s,总共进行40次循环。miR-663b测定反应条件为:95 ℃预变性5 min;然后95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,共进行40次循环。以U6和GAPDH分别作为miRNA和mRNA的内对照,以2-△△CT法计算基因的相对表达量,每组实验重复3次,结果取均值。

表1 引物名称及其序列

1.7 免疫印迹法检测A～D组NPCs IL1R1的相对表达量

使用移液枪吸除A～D组二代NPCs的培养液,并用PBS轻柔冲洗3次。使用加有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液,在碎冰上提取各处理组中NPCs蛋白[11]。使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度,每孔上样20 μg蛋白,在含有150 g/L分离胶和50 g/L浓缩胶的SDS-PAGE凝胶中电泳分离,先恒压80 V电泳30 min,后调整电压至120 V,电泳1 h。随后在冰上将蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上,转膜电流300 mA,时间2 h。用TBST漂洗3次PVDF膜后浸泡在脱脂牛奶中封闭2 h。封闭结束后TBST漂洗3次,在4 ℃条件下与一抗孵育过夜。第2天回收一抗,加入辣根过氧化物酶标记过的二抗,室温下孵育2 h。二抗孵育结束后,用TBST漂洗条带3次,随后滴加增强型特敏发光液进行显影并拍照,以β-actin作为内参照,使用Image J软件对条带灰度值进行分析,IL1R1蛋白的相对表达量以IL1R1蛋白灰度值/β-actin蛋白灰度值计算。

1.8 CCK-8法检测A～D组NPCs的增殖情况

将A～D组二代NPCs重悬并接种于96孔板中,密度为每孔约2×103个细胞,培养3 d后在相应孔中加入CCK-8试剂,继续在37 ℃下孵育2.5 h,然后用酶标仪测定波长450 nm处的吸光度(A)值,细胞活性用A值表示。

1.9 TUNEL染色法检测A～D组NPCs凋亡情况

在4 ℃条件下将A～D组二代NPCs爬片浸入40 g/L的多聚甲醛溶液中,固定20 min,随后PBS漂洗3次,使用0.2%的TritonX-100通透液浸泡5 min,PBS漂洗后加入适量凋亡检测液放入湿盒中,37 ℃下孵育60 min。加入DAPI,室温避光孵育8 min,PBS冲洗,加抗淬灭剂封片。在荧光显微镜下观察,所有细胞核呈蓝色,TUNEL染色阳性细胞(发生凋亡细胞)呈红色,细胞凋亡情况用凋亡率表示(凋亡率=阳性细胞数/总细胞数)。

1.10 双荧光素酶报告基因检测及分析

在TargetScanHuman 7.1以及miRbase生物信息数据库中筛选并且鉴定miR-663b的靶基因IL1R1[12],将IL1R1 3′端非翻译区(UTR)基因片段插入pGL3 promoter载体,并参考IL1R1-野生型(wt)基因序列设计出IL1R1-突变型(mut)基因序列,同样嵌入质粒中进行扩增,载体的构建由上海唯问生物科技有限公司完成。将购自普诺赛科技有限公司生长良好293T细胞按实验需求分别转染IL1R1-3′UTR-wt质粒+miR-663b mimic(E组)、IL1R1-3′UTR-wt质粒+miR-663b mimic NC(F组)、IL1R1-3′UTR-mut质粒+miR-663b mimic(G组)、IL1R1-3′UTR-mut质粒+miR-663b mi-mic NC(H组),转染24 h后,收集细胞并裂解。使用双荧光素酶报告检测系统测定各组细胞荧光素酶活性,以海肾荧光素酶活性作为内参照。

1.11 统计学处理

2 结 果

2.1 NPCs炎症模型构建

以0、5、10、20 μg/L的IL-1β处理后,各浓度下NPCs miR-663b相对表达量分别为1.00±0.01、0.63±0.05、0.32±0.68、0.36±0.61,组间比较有显著差异(F=108.20,P<0.01),但10、20 μg/L浓度间无显著差异(t=0.66,P>0.05),故确定10 μg/L为IL-1β最佳处理浓度。以IL-1β分别处理0、12、24、48 h后,不同处理时长NPCs miR-663b相对表达量分别为1.00±0.01、0.60±0.14、0.51±0.09、0.45±0.06,组间相比较有显著差异(F=24.33,P<0.01),但是24 h较48 h无显著差异(P>0.05),因此后续实验选择浓度10 μg/L的IL-1处理24 h构建NPCs炎症模型。

2.2 miR-663b对A～D组NPCs中TNF-α、IL-6、IL-1β、Ⅱ型胶原蛋白和多聚糖蛋白基因表达影响

RT-qPCR结果显示,miR-663b在4组中表达量比较差异有显著性(F=141.30,P<0.01),C组与其他组比较miR-663b表达量均显著性升高(t=9.41～22.93,P<0.01)。4组中炎症因子基因表达比较均有显著差异(F=20.27～125.70,P<0.01),与B、D组相比,C组TNF-α、IL-6、IL-1β基因相对表达量均明显降低(t=3.17～32.51,P<0.01),A组亦降低(t=12.58～23.11,P<0.01);B、D组相比无显著差异(P>0.05)。4组中Ⅱ型胶原蛋白及多聚糖蛋白基因表达差异有显著性(F=14.96、30.02,P<0.01),与B、D组相比,C组Ⅱ型胶原蛋白、多聚糖蛋白基因相对表达量均显著升高(t=4.09～6.47,P<0.01),A组亦升高(t=3.27～3.96,P<0.01);B、D组相比则无显著差异(P>0.05)。见表2。

表2 各组miR-663b及炎症因子、Ⅱ型胶原蛋白、多聚糖蛋白基因的相对表达量比较

2.3 miR-663b对A～D组NPCs增殖及凋亡影响

CCK-8实验结果显示,A～D组二代NPCs培养3 d以后细胞活性值分别为1.66±0.17、1.16±0.13、1.45±0.02、1.10±0.01,4组细胞活性值比较差异有显著性(F=16.97,P<0.05);与B、D组相比,C组细胞活性值均显著升高(t=3.14、3.96,P<0.01),A组细胞活性值亦升高(t=3.18、3.21,P<0.01);B、D组相比无显著差异(P>0.05)。

TUNEL染色结果显示,A～D组中二代NPCs凋亡率分别为0.96±0.05、4.20±0.03、1.10±0.01、4.06±0.05,4组NPCs凋亡率比较差异有显著性(F=7 030.00,P<0.01)。与B、D组相比,C组细胞凋亡率均显著降低(t=4.28、168.61,P<0.01),A组细胞凋亡率亦降低(t=3.68、100.04,P<0.01);B、D组相比无显著差异(P>0.05)。

2.4 miR-663b对A～D组NPCs中IL1R1基因及蛋白相对表达量的影响

RT-qPCR结果显示,A～D组中IL1R1基因相对表达量分别为0.71±0.06、1.39±0.17、0.27±0.08、1.20±0.08,4组NPCs的IL1R1相对表达量比较差异有显著性(F=62.21,P<0.01);与B、D组相比,C组IL1R1相对表达量显著降低(t=6.48、12.84,P<0.01),A组IL1R1相对表达量显著降低(t=5.18、10.07,P<0.01);B、D组相比无显著差异(P>0.05)。

免疫印迹法结果示,A～D组IL1R1蛋白相对表达量分别为0.26±0.01、0.45±0.02、0.30±0.03、0.51±0.02,4组比较差异有显著性(F=82.11,P<0.01),与B、D组相比,C组IL1R1相对表达量显著降低(t=6.39、9.69,P<0.01),A组IL1R1相对表达量亦显著降低(t=12.34、19.51,P<0.01);B、D组相比无显著差异(P>0.05)。见图1。

图1 4组NPCs免疫印迹检测结果

2.5 E～H组NPCs的双荧光素酶活性分析结果

双荧光素酶报告基因实验结果显示,E～H组的荧光酶活性值分别为28.90±1.25、45.66±2.43、41.54±1.23、45.54±1.26,4组比较差异具有显著性(F=71.07,P<0.01)。E组与其他3组比较荧光酶活性值显著降低(t=10.62～16.27,P<0.01),其余3组两两比较均无显著差异(P>0.05)。

3 讨 论

髓核组织位于脊柱纤维环中心,上下终板之间,是维持椎间盘平衡以及稳态必不可少的组分[13]。NPCs表型发生改变、促炎递质表达上调、活性细胞数量减少及细胞外基质含量下降被认为是IDD发生的主要病理特征,上述病理特征也导致了局部细胞微环境的改变,此类改变可以进展到IVD结构和功能的损害[14]。炎症因子的升高是推动这一级联事件的关键因素[15],因此抑制NPCs炎症反应和凋亡是治疗IDD的重要策略。

既往研究发现,退变椎间盘组织中IL-1β水平显著升高参与了IDD的多个病理过程[16-17]。IL-1β引起基质生物学改变是IDD的特征[18-19]。IL1R1作为一种重要的免疫调节因子,在参与自身炎症反应和调节免疫平衡方面发挥着重要作用,而IL1R1对于所有IL-1β介导的信号转导事件都是必不可少的[20]。IL-1β与IL1R1结合在蛋白辅酶协助下诱导活性蛋白磷酸化,最终导致NF-κB激活,加剧细胞炎症和凋亡。随着分子芯片技术和微阵点分析技术的发展,越来越多证据表明miRNA在细胞分化、增殖和生存中发挥核心作用。近年来,miRNA被发现在介导细胞增殖和凋亡、炎症反应以及细胞外基质降解等方面具有广泛作用,众多研究者将miRNA如何有效阻断NPCs凋亡作为缓解IDD的研究重点[21]。JI等[22]从临床数据集的miRNA芯片分析及体内外实验中证实,miR-141通过与SIRT1/NF-κB通路相互作用,一定程度上促进IDD进展。DU等[23]研究发现抑制miR-133a-5p表达或增加FBXO6表达可能是治疗IDD的有效策略。

本研究显示,miR-663b在IL-1β构建的NPCs炎症模型中表达下调,且呈剂量和时间依赖性。在证明了miR-663b在IL-1诱导的NPCs炎症模型中表达下调后,本研究进一步探究了过表达miR-663b是否可以缓解NPCs炎症和改善细胞基质成分的表达。实验表明,过表达miR-663b的C组相比较于其他组,TNF-α、IL-6、IL-1β的表达被明显抑制,而Ⅱ型胶原蛋白以及多聚糖蛋白基因的相对表达量明显增高,这些结果均表明miR-663b在IL-1β刺激NPCs细胞的炎症反应中起保护作用。本研究CCK8法及TUNEL染色结果显示,C组相比较于其他组NPCs活性显著上升,NPCs凋亡率显著下降,上述结果表明miR-663b可以有效减缓NPCs炎症反应,改善细胞基质分子的降解及NPCs的凋亡。另外,生物信息库分析及双荧光素酶报告基因实验证实miR-663b的下游靶点基因是IL1R1,说明了miR-663b通过抑制IL1R1表达,起到了减缓NPCs炎症反应的作用。以上均表明miR-663b在IDD的进展中发挥重要作用,为探索IDD的病理机制提供了新的研究方向。

综上所述,本研究发现miR-663b可以通过与IL1R1靶向结合下调IL1R1表达,从而减缓NPCs炎症反应和凋亡进程,miR-663b及其抗炎机制或可为IDD研究提供更多理论基础。

伦理批准和知情同意：本研究涉及的所有试验均已通过青岛大学附属医院医学伦理委员会的审核批准(文件号QYFYWELL27201)。所有试验过程均遵照《涉及人的生物医学研究伦理审查办法》的条例进行。受试对象或其亲属已经签署知情同意书。

作者声明：李亚雄、马学晓、刘勇参与了研究设计;李亚雄、常胜、魏嘉豪参与了论文的写作和修改。所有作者均阅读并同意发表该论文。所有作者均声明不存在利益冲突。