抗菌声动力疗法的作用机制及其抗菌效果影响因素的研究进展

李 芳, 李红艳, 潘启源, 郭晶莹, 刘 敏

（吉林大学口腔医院牙周科，吉林 长春 130021）

细菌感染是全球医学领域重点关注的问题，虽然抗生素在对抗感染性疾病方面颇有成效，但随着耐药菌株，特别是多重耐药菌的不断增加，抗生素的治疗效果明显降低，因此寻找能够替代抗生素的新型抗菌方法成为治疗细菌感染性疾病的迫切要求［1］。抗菌声动力疗法（antibacterial sonodynamic therapy，aSDT） 是在声动力疗法（sonodynamic therapy，SDT） 的基础上发展起来的一种应用前景较好的抗菌方式，aSDT 是利用超声激发声敏剂，产生活性氧（reactive oxygen species，ROS）来 实 现 对 细 菌 的 杀 伤 作 用［2］。2011 年，LIU 等［3］首次发现：声动力对细菌具有杀伤作用，其测定了氟喹诺酮类药物（fluoroquinolones，FQS）在施加40 kHz 超声刺激和无超声刺激的情况下对大肠杆菌的抑菌效果，发现超声能激活FQS 产生ROS，降低细菌的存活率，明显提高FQS 的抗菌效果。aSDT 因其独特的作用机制，对细菌不产生耐药性，为解决抗生素导致的细菌耐药性的问题提供了一种新思路，另外超声波具有优越的组织穿透性，在软组织中的穿透深度可以达到10 cm 以上［4］，能够瞄准位于生物体深处的细菌，在治疗深层感染方面具有较大优势和前景［5］。近年来， aSDT 在抗菌领域的研究已取得许多进展，但关于其作用机制和影响因素的系统综述仍较少见。本文作者结合近些年国内外相关研究，从aSDT 的作用机制及影响其抗菌效果的相关因素方面进行综述。

1 aSDT 的作用机制

aSDT 的具体作用机制尚未完全阐明。目前公认的aSDT 作用机制是以超声空化效应为基础的理论，包括基于ROS 的声化学效应以及基于超声的声力学效应。超声空化效应是指超声与液体环境相互作用导致的一种独特的物理现象，分为稳定空化和惯性空化两大类［6］。稳定空化是指微小气泡发生振荡引起液体流动发生周围介质的混合；惯性空化是指在超声的作用下液体中产生的气泡迅速增长、急剧收缩和破裂的过程，气泡破裂的瞬间产生剪切应力和冲击波等声力学效应以及局部高温高压等声化学效应［7］。

1.1 基于ROS 的声化学效应

研 究 者［8］认 为：ROS 为aSDT 的 主 要 杀 伤 因子，主要参与细胞的氧化应激反应。ROS 由超声激活声敏剂产生，即声敏剂在吸收超声的能量后可被激活产生单线态氧（1O2）、羟基自由基（·OH）、超氧阴离子（·O2-） 或过氧化氢（H2O2） 等活性氧。1O2可以引起细胞膜的氧化和降解，对细菌产生不可逆性的损害；·OH 是一种强且非选择性的氧化剂，几乎可以破坏所有类型的有机生物分子，包括碳水化合物、核酸、脂质、蛋白质、DNA 和氨基酸；虽然·O2－不是强氧化剂，但是作为1O2和·OH 的前体，其亦具有重要的生物学意义［9］。

1.1.1 ROS 的产生机制 目前，超声激活声敏剂产生ROS 存在2 种机制：声致发光和热解效应。声致发光指US 空化过程中，气泡内爆快速释放能量时可以短暂地发出光的现象，声敏剂被光从基态激发到高能三线态，与氧气（O2）分子或生物底物相互作用产生活性自由基或直接将能量传递给O2生成1O2，1O2作为主要效应器，诱导细胞成分的光氧化，最 终 导 致 细 胞 死 亡［10］。RAHMAN 等［11］采 用二氧化钛（titanium dioxide，TiO2）作为声敏剂应用于超声杀菌消毒领域，认为其杀菌机制主要是在超声作用下气泡内爆瞬间发出的紫外光激发TiO2产生ROS，ROS 对细菌产生杀伤作用。最近，BEGUIN 等［12］也提供了在SDT 过程中声致发光的直接证据，在超声作用下，气泡空化过程中发生声致发光作用，产生的光激活了光/声敏剂，从而产生更多的ROS，也证实了光强度与气泡声发射的宽带能量呈正相关关系。

热解效应是指局部温度和压力因惯性空化过程而升高，促使声敏剂和（或）水分子在气液界面或坍塌的气泡内部发生热解生成自由基［13］，在此过程中形成的自由基可以与氧气反应生成过氧基和烷氧基，诱导细胞毒性损伤。相关研究［14］显示：热解水分子产生的·OH 反应活性较高、半衰期较短且扩散距离短，因此关于其在细菌破坏中的作用尚未阐明［15］。热解声敏剂过程中产生的H2O2反应活性较低、半衰期长且扩散距离较长，可以攻击细菌的关键位点。因此选择合适的声敏剂对于最大限度地发挥SDT 的热解效应至关重要。

1.1.2 ROS 作用于细菌的靶点 ROS 可以与细菌的不同成分相互作用诱导细菌死亡，目前存在3 个细菌靶点：细胞膜磷脂、膜蛋白和核酸。ROS 通过破坏上述靶点可以诱导细菌发生形态损伤和功能变化：形态损伤主要指细菌结构的改变，ROS 直接破坏细菌细胞壁和内膜从而破坏细胞膜的完整性，造成细菌胞内内容物泄漏，进而导致膜运输系统失活；功能改变则通常由膜电位紊乱、蛋白质和酶活性丧失及代谢过程（如DNA 复制和葡萄糖转运）的抑制［16］引起；通常上述2 种类型的变化同时发生。PANG 等［17］构建了1 个智能纳米脂质体平台，命名为MLP18，通过扫描电镜观察到由MLP18 介导的aSDT 处理后的细菌形态发生了显著变化，细胞壁起皱和裂解，细菌胞内内容物明显泄漏。为进一步研究细菌破坏的机制，PANG 等［17］定量检测了MLP18 在超声过程中产生的ROS 水平，发现MLP18 和超声联合作用时ROS 水平明显高于MLP18 或超声单独作用时。上述结果说明MLP18 介导的aSDT 的抗菌活性与ROS 的形成有关，ROS 诱导的细菌形态和功能损伤是aSDT 的潜在杀菌机制。

1.2 基于超声的声力学效应

超声本身会产生机械剪切力和冲击波等声力学效应，对细胞膜造成物理性损伤［18］。有学者将细胞毒效应归因为单纯的声力学效应。WORTHINGTON 等［7］通过评估细胞外产生自由基的量，发现自由基产量过少无法解释其导致的细胞死亡，其将细胞死亡归因于超声空化产生的机械剪切力。另外，超声还可以改变细胞膜的通透性、增加声敏剂和药物的吸收及积累［19-20］。RUNYAN等［21］证实：超声可以增加铜绿假单胞菌细胞膜对大分子蛋白的通透性，其认为这种现象可能是由于超声的机械剪切力作用于细胞膜形成声孔造成细胞膜通透性变大。添加膜不稳定化合物如抗生素和声敏剂等可以放大机械剪切力，与超声起到协同作用，造成细胞膜破坏。COSTLEY 等［22］制备了孟加拉玫瑰-抗菌肽结合物作为声敏剂，采用超声处理金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌后，声敏剂扩散速度提高了2.6 倍，提示超声增加了细胞膜的通透性，加速了细菌对声敏剂的摄入。

2 aSDT 作用效果的影响因素

aSDT 包括超声波、氧气和声敏剂这3 个基本要素［23］，通过对上述因素进行不同程度调控可以调节aSDT 抗菌的作用效果，超声波通常最易控制，氧气最难确定，不同声敏剂对aSDT 的有效性和安全性有不同影响。有研究者［24］认为细菌类型和结构亦会影响aSDT 的作用效果。

2.1 超声参数

超声波是一种由频率高于人类听觉极限的声波产生的振动能量。频率小于1 MHz 的超声定义为低频超声，强度小于3 W·cm－2的超声定义为低能超声［25］。目前，大部分研究采用的是低频低能超声来探讨aSDT 的抗菌效果。

随着超声波频率的增加，超声空化作用时气泡的振荡半径变小，因此，超声波频率是决定气泡动力学的重要因素。研究［26］显示：大多数声敏剂可以 被0.2～3.0 MHz 的 超 声 波 激 发。HAO 等［27］通过对C6 胶质瘤细胞施加不同频率超声，研究了超声频率对声动力作用的影响的实验结果显示：细胞活力和超声频率的增加成正比，采用0.5、0.8和1.0 MHz 超声处理，细胞存活率分别为43%、57%和60%，随着超声频率降低，细胞毒性增加，但是频率本身并非决定SDT 效果的关键，将频率与适当类型和浓度的声敏剂相结合，对于触发控制细胞死亡所需的生物反应是至关重要的。分别采用光卟啉［28］和二磺基二邻苯二甲酰亚胺甲基酞菁［29］作为声敏剂，采用0.5 W·cm－2、1 MHz 的超声波处理U251 细胞后，二磺基二邻苯二甲酰亚胺甲基酞菁处理后细胞死亡率高于80%，而光卟啉处理使细胞死亡率不足50%。在这种情况下，声致发光可能在声动力效应中起重要作用，由超声波和声敏剂相互作用产生的降解产物也可能在细胞死亡中起一定作用，具体作用机制有待更深层次的探讨。

通常采用的超声强度为0.5～10.0 W·cm－2［30］，低强度超声可以激发声敏剂产生适量的ROS，改变细胞膜的通透性，细胞结构仍保持相对完整。SHEVCHENKO 等［31］制备了负载多糖（右旋糖酐）涂层的硅纳米粒子作为声敏剂，采用1 和3 W·cm－2超声分别处理大肠杆菌10 min 后，抑菌率分别为35%和100%，表明随着超声强度的增高，杀菌效率也相应提升。虽然高强度超声产生了更多的ROS，对细菌结构的破坏程度更为严重，但其亦对周围正常的组织或细胞造成一定的损伤。REDISKE 等［32］的研究将带有大肠杆菌生物膜的圆盘植入新西兰白兔背部皮下，分别采用相同频率（28.48 kHz）、不同强度（100 和300 mW·cm－2）超声连续治疗24 h，取出圆盘并测定圆盘上的活细菌数量，结果显示：100 mW·cm－2超声对细菌的杀伤作用并不明显，300 mW·cm－2超声可明显降低细菌活性，且可明显地观察到兔的皮肤组织受到损伤。因此，为了保护正常的组织和细胞，在aSDT 的研究中广泛采用的是低强度超声。

2.2 O2

O2对于ROS 的产生至关重要，然而，大多数细菌感染部位为缺氧的微环境，再加之aSDT 过程中会消耗大量O2，进一步加重了其缺氧状态，使治疗效果降低。一些学者通过整合无机纳米酶建立了治疗效果显著的声动力学平台，通过酶催化的方式将内源性H2O2转化为O2，使感染微环境的缺氧状态得到明显缓解，有利于ROS 的产生，增强治疗效果。SUN 等［33］提出了一种可切换的纳米酶系统Pd@Pt-T790，T790 可以阻断Pd@Pt 的过氧化氢酶样活性，但在超声激活下，Pd@Pt 的酶活性得到恢复，催化内源性H2O2分解为O2，从而减轻缺氧情况，提高aSDT 的疗效，并将其成功应用于治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌所致的深部细菌感染性疾病。

2.3 声敏剂

声敏剂被认为是影响抗菌效果最重要的因素。近年来声敏剂得到了迅速发展，一般分为有机声敏剂和无机声敏剂，具有很大的应用潜力，设计高效的声敏剂是aSDT 研究中的重要课题。

2.3.1 有机声敏剂 早期使用的声敏剂是有机小分子，卟啉类衍生物是第一代也是目前研究最多的声敏剂，主要包括血卟啉单甲醚（hematoporphyrin monomethyl ether，HMME）、原卟啉Ⅸ和光卟啉等。ZHUANG 等［34］研究了HMME 介导的aSDT对金黄色葡萄球菌的灭活效果， 50 mg·L－1HMME、6 W·cm－2超声处理可以杀灭超过95%的金黄色葡萄球菌，且随着HMME 浓度和超声强度的升高，杀菌效率也相应提高。此外，还有一些有机分子例如叶绿素、竹红菌素B、孟加拉玫瑰和姜黄素等也可以被US 激活，并且取得了较好的灭菌效果。WANG 等［35］采用竹红菌素B 作为声敏剂对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌进行超声处理，与对照组比较，US 组细菌死亡数明显增多，细胞膜完整性 明 显 受 损。POURHAJIBAGHER 等［36］制 备 了纳米姜黄素探讨其对变形链球菌的杀伤效果，纳米姜黄素治疗1 min 可以达到99.9%的抑菌率，与姜黄素比较，纳米姜黄素介导的aSDT 细胞毒性较小，ROS 水平和抗菌活性最高，能有效抑制变形链球菌的生长。尽管许多有机小分子被发现具有潜在的声动力效应，但因其生物利用度和稳定性较低、体内清除较快，从而阻碍了其在临床上的应用。因此，需要对有机小分子进行修饰或引入佐剂，克服上述缺点，从而提高其实际应用效果。

2.3.2 无机声敏剂 无机纳米材料具有相对优异的物理化学性质和较高的稳定性，在生物医学领域具有广阔的应用前景。近年来，基于无机纳米颗粒的声敏剂在aSDT 中得到了广泛应用。TiO2是一种传统的无机纳米声敏剂，DADJOUR 等［37］采用超声处理系统对嗜肺军团菌进行消毒的结果显示：在无TiO2、0.2 g·mL－1TiO2和1.0 g·mL－1TiO2条件下，采用超声作用30 min 后，细菌数量分别下降了18%、94%和103，这表明增加TiO2用量可以在一定程度上提高消毒效果。SU 等［38］通过在钛（Ti）种植体上掺杂硫（S）产生氧空位（Ti-S-TiO2-X）的方式，使种植体具有了很强的声动力效应和光热效应，超声和近红外光联合作用15 min 后，对金黄色葡萄球菌的抗菌率达到99.995%。除了传统的TiO2，一些其他无机纳米材料例如硅（Si）［39］、四氧化三铁（Fe3O4）［40］和黑磷（BP）［41］等也被证明具有声动力的潜能，贵金属如金（Au）、银（Ag）和铂（Pt）可以与纳米材料结合，通过阻止电子-空穴复合和增加活性氧的数量来提高aSDT 的效率。WU 等［42］开发了一种负载Au NPS的钛酸钡纳米复合压电材料Au@BTO。超声波触发Au@BTO的压电效应，促进电子-空穴对的分离，增加ROS的产生，对典型的革兰阴性菌和革兰阳性菌均显示出较高的抗菌效果。声动力学过程还可促进成纤维细胞迁移，有助于小鼠皮肤伤口愈合。

2.4 细菌类型和结构

不同种类的细菌在细胞结构和组织结构上表现出较大的差异，影响了声敏剂与细菌之间的相互作用。革兰阳性菌的细胞壁结构简单，细胞壁与细胞膜结合并不紧密，有利于声敏剂的进入。而革兰阴性菌具有复杂的细胞壁多层结构，由细胞内膜和细胞外膜构成，细胞外膜是由脂质双分子层和多糖-脂多糖组成［43］。虽然革兰阴性菌的细胞壁厚度很薄（2～5 nm），但是脂多糖的存在保证了菌体结构不易被破坏，同时还能阻挡声敏剂、溶菌酶和抗生素等较大分子进入细菌内部［44］。因此，相较于革兰阴性菌，革兰阳性菌更对 aSDT 更敏感。XU 等［45］对比了同样US 频率和强度下采用二氢卟吩e6 （chlorin e6，Ce6）作为声敏剂对革兰阳性菌（金黄色葡萄球菌）和革兰阴性菌（大肠杆菌）的杀伤效果，检测菌落形成单位（colony forming unit，CFU）结果显示：在1.0 MHz、1.56 W/cm－2的条件下，大肠杆菌的CFU 下降2－log，金黄色葡萄球菌降低7－log，证明了Ce6 的声动力作用对革兰阳性菌和革兰阴性菌均有抗菌作用，且对革兰阳性菌的抗菌作用更强。

抗生素滥用导致的耐药菌株的出现是目前治疗细菌感染性疾病面临的重大挑战。常见的耐药菌株包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌等。aSDT 是通过声敏剂响应超声产生ROS 来实现位点特异性细胞毒性，对细菌不产生耐药性。β-内酰胺类抗生素（如甲氧西林）的过度使用导致耐甲氧西林金黄色葡萄球菌出现并在全球传播，成为医疗保健和社区环境中细菌感染的主要原因。YU 等［46］制备了1 种超声激活的单原子催化剂，该催化剂由金纳米棒驱动的单原子掺杂卟啉金属有机骨架（HNTM-Pt@Au） 和红细胞膜组成，经超声处理1 5 min 后，其对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抗菌效率为 99.9%。鲍曼不动杆菌作为一种耐多药和侵袭性病原体，已被公认为是肺炎、败血症、脑膜炎、泌尿道和伤口感染的病原体［47］。POURHAJIBAGHER 等［48］合成了姜黄素-乳链菌肽基聚（L-乳酸） 纳米颗粒（CurNisNp），发现鲍曼不动杆菌的细菌活力与CurNisNp 的浓度、光照时间和超声强度呈负相关关系。LIU 等［49］研究显示：低频超声可以增强黏菌素-万古霉素对鲍曼不动杆菌耐药生物膜的抗菌活性。也有研究［4，22］显 示aSDT 对 铜 绿 假 单 胞 菌 具 有 明 显 的 抑制效果。

自然界中细菌多数以生物膜的形式存在，生物膜是结构复杂的细菌群落，细菌附着并嵌入至由胞外多糖、DNA 和蛋白质组成的细胞外基质中［50］。人体中约80%的慢性和复发性细菌感染是由细菌生物膜引起的，与浮游细菌比较，生物膜中的细菌对抗生素的抵抗力增强［51］，因此，aSDT 作用于生物膜的研究对于指导临床治疗细菌感染性疾病更具意义，aSDT 联合其他疗法对生物膜的清除效果较为 显 著。ALVES 等［52］采 用aSDT 和aPDT 分 别 处理白色念珠菌的浮游细菌和生物膜，并测定细菌的存活率结果显示：aSDT 或aPDT 单独应用对浮游菌的杀伤效果明显，但是其对生物膜的清除作用并不显著。当aSDT 和aPDT 联合使用时，生物膜的活力和总生物量降低，其采用荧光显微镜评估生物膜的形态和结构发现：aSDT 联合aPDT 处理后，生物膜密度明显降低，且主要由死细胞构成，原因可能为超声促进了生物膜基质中声孔的产生，促进了声敏剂向生物膜的扩散，提高了aSDT 的疗效。

3 总结和展望

aSDT 作为一种新兴的抗菌治疗方法，安全性较高，抗菌效果显著，为临床上治疗细菌感染性疾病提供了新思路。了解其具体作用机制对进行临床试验必不可少。以往的研究缺乏对超声领域的全面表征，声学参数和实验设置参数的不同使得数据的定量比较较难实现，在相同的条件下进行大量实验才能确定最佳的频率强度等参数。近年来，尽管在开发具有良好生物相容性和靶向能力的新型纳米声敏剂方面的研究进步较大，但仍存在一些复杂的制备方法、正常组织的不良反应及靶向性欠佳等问题有待解决。进一步的研究应集中于通过优化其结构和声动力学能力来探索具有良好靶向特异性和治疗效果的新型声敏剂。