清化凉血护络汤预防大鼠急性放射性肠炎的作用及机制研究

董豆,朱琳,王坚,沈伟生,殷华芳,顾一航,殷泉忠,沈卫东

(1.南通大学 医学院,江苏 南通 226000; 2.南通大学 附属江阴医院,江苏 江阴 214400)

放射治疗是盆腔恶性肿瘤不可或缺的治疗手段,射线对肿瘤起杀伤作用的同时也可能会引起肿瘤周围危及器官的放射性损伤,其中以放射性肠炎(radiation enteritis,RE)较为常见[1]。患者常出现腹痛、大便次数增多、便血、恶心呕吐等不适,迁延不愈者可能进一步引起消化道大出血、穿孔、梗阻、肠瘘等严重并发症[2]。目前针对RE的临床治疗主要以保守对症、肠道营养治疗为主,必要时行手术、内镜治疗。总体疗效并不十分理想,无有效预防和治愈的措施。由于中药疗法本身有着药物副作用较小、并发症较少等优点,可长期改善病人RE症状,减少了病人痛苦[3]。

江苏省名中医沈伟生致力于研究中医药治疗放射性肺炎、放化疗所致心脏损伤等方面的问题[4-5],在中医药防治放化疗毒副反应领域取得了丰富成果。沈伟生名中医认为,盆腔放疗引起放射性损伤,其主要病机为邪热(火毒)下注、湿热蕴结、血热灼络而表现为大便频数、腹痛、里急后重、血便、直肠瘘等消化系统症状。针对RE基本病机,其自拟清化凉血护络汤应用于预防和治疗盆腔恶性肿瘤放疗引起的RE,具体方药如下:黄柏10 g,苍术10 g,黄芩10 g,白芍30 g,老鹳草15 g,仙鹤草30 g,紫草30 g,红景天30 g,地榆10 g,败酱草15 g,大血藤30 g,马齿苋15 g。清化凉血护络汤前期在临床探索中已取得满意的疗效,盆腔放疗患者联合该药方治疗后RE的发生率降低,消化道症状减轻,患者的生活质量有所提高。基于此本实验通过建立急性RE模型,进一步探讨清化凉血护络汤对大鼠急性RE的预防作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 健康成年SPF级Wistar大鼠36 只,体重(200±20)g,由常州卡文斯公司提供。

1.1.2 药物 清化凉血护络汤组方:黄柏、苍术、黄芩、白芍、老鹳草、仙鹤草、紫草、地榆、败酱草、大血藤、马齿苋。以上中药均为颗粒剂,由江阴天江药业有限公司提供。

1.1.3 主要试剂及仪器试剂 试剂:苏木素(Sigma),伊红(水溶性)、无水乙醇、二甲苯、盐酸、中性树胶(中国医药集团有限公司)。仪器:Synergy直线加速器(瑞典医科达医疗器械有限公司),倒置显微镜(OLYMPUS)。环氧合酶-2(COX-2)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)和热休克蛋白90α(Hsp90α)酶联免疫吸附分析(ELISA)检测试剂盒(上海钰博生物科技有限公司)。

1.2 实验动物分组及给药

所有大鼠按照随机数字表法分为对照组、模型组、低剂量组及高剂量组,每组9只,随机编号称重。适应性饲养1周后进行实验。根据人与动物体表面积换算法[6],将自拟清热凉血组方煎制成汤剂,高剂量组按照0.08 g·ml-1·kg-1的剂量,于建模前7 d开始按照2 次·d-1、1 ml·次-1灌胃给药,照射后12 h继续给予清化凉血护络汤灌胃10 d,低剂量组按高剂量组剂量稀释4倍进行灌胃给药(方法同上);对照组与模型组大鼠给予相同体积生理盐水灌胃。建模给药后第4、7、10 天每组分别随机处死3 只大鼠,腹主动脉取血保存血清,取肠组织保存备用。

1.3 RE大鼠模型制备

所有大鼠适应性喂养3 d,禁食禁水12 h后称重。采用10%水合氯醛麻醉,麻醉后以仰卧体位将其四肢固定于特制照射板上,采用6 MV直线加速器对大鼠进行腹部X线照射,照射自耻骨联合至肛门,照射野面积2 cm×5 cm,其余部位用5 cm厚铅板遮挡,100 cm源皮距,行单次照射600 cGy·min-1,总体照射剂量17.5 Gy,建立大鼠急性RE模型。照射后大鼠出现摄食、饮水量减少,体重下降,精神萎靡,蜷缩少动、稀便及血便,表明造模成功[7]。

1.4 一般情况观察

观察并记录各组大鼠每日的摄食摄水及体重。根据相关文献[8-9]拟定对建模后第4、7、10 天大鼠一般情况的评分标准,见表1。

表1 大鼠一般情况评分

1.5 HE染色观察回肠及直肠黏膜病理变化

(1) 回肠:取照射部位回肠2 cm左右,用甲醛固定,固定后用预冷的生理盐水洗净血液,包埋、切片、染色。显微镜下观察组织学变化,计数各组小肠绒毛隐窝细胞数、隐窝深度、绒毛长度及单位面积的肠腺,并计算建模后肠腺存活率,肠腺存活率=照射肠片上肠腺绒毛比/正常肠片上肠腺绒毛比×100%[10]。(2) 直肠:将10%甲醛固定好的2 cm直肠上段乙醇脱水,浸蜡包埋,HE染色,参照Hovdenak评分标准[11],光镜下观察黏膜上皮表面、腺体、固有层结构,根据其特征进行评估,最低分为0分, 最高分为12分, 分值越高代表黏膜病理改变越严重。

1.6 ELISA检测大鼠血清COX-2、TNF-α、IL-6、Hsp90α含量

于建模给药后第4、7、10 天对照组、模型组、高剂量组分别随机处死3 只大鼠,腹主动脉取血保存血清,采用COX-2、TNF-α、IL-6和Hsp90αELISA检测试剂盒,严格按照说明书操作,在酶标仪上检测并分析其含量。

1.7 统计学处理

2 结 果

2.1 各组大鼠摄食、摄水和体重观察结果

高剂量组、低剂量组及模型组建模后5 d摄食和摄水均小幅度下降,第6 天开始逐渐恢复;且各组大鼠各时间段体重无明显变化。见图1。

图1 建模后各组大鼠摄食摄水及体重变化

2.2 建模后第4、7、10天各组大鼠一般征象评分结果

低剂量组及高剂量组各时间段评分均显著低于模型组,且高剂量组评分更低,差异有统计学意义(P<0.01),见表2。提示清化凉血护络汤可控制炎症渗出,有效改善大鼠腹泻及黏液等症状,且高剂量改善效果更为显著。

表2 建模后第4、7、10 天各组一般征象评分 分

2.3 回肠HE染色结果

2.3.1 回肠肠腺存活率 建模后高剂量组、低剂量组及模型组回肠肠腺存活率较对照组显著下降(P<0.01);低剂量组显著高于模型组,高剂量组较低剂量组更能有效提高肠腺存活率,差异均有统计学意义(P<0.01)。见表3。

表3 建模后第4、7、10天各组回肠肠腺存活率的变化 %

2.3.2 回肠绒毛高度及隐窝深度 对照组小肠绒毛上皮细胞形态正常,排列有序,腺体丰富;模型组绒毛变短、稀疏,上皮不完整,上皮细胞脱落,腺体裸露,隐窝深度降低,炎症细胞浸润;低剂量组可见绒毛及隐窝深度有较轻程度的病理损害,高剂量组仅有轻微黏膜上皮细胞坏死脱落,见图2。建模给药第10天低剂量组及高剂量组绒毛高度、隐窝深度均高于模型组,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01),见表4。说明清化凉血护络汤能提高肠组织绒毛高度及隐窝深度,对大鼠肠道黏膜损伤具有显著防治作用,且作用强度与药物浓度有相关性。

黑色箭头为绒毛高度,白色箭头为隐窝深度图2 各组大鼠回肠绒毛高度及隐窝深度(HE染色 主图×200,右上角小图×40)

表4 照射后第4、7、10 天各组绒毛高度和隐窝深度的变化 μm

2.4 直肠病理变化及Hovdenak评分

光镜下观察直肠黏膜上皮表面、腺体、固有层结构特征,可以看到大量炎症性浸润,隐窝细胞及杯状细胞消失,见图3。采用Hovdenak评分系统量化评分,结果提示模型组得分较对照组显著升高;高剂量组、低剂量组相对于模型组而言能显著降低直肠Hovdenak评分,且高剂量组降低更明显,差异均有统计学意义(P<0.01),见表5。

圆形为炎性浸润,三角形为隐窝消失,椭圆形为杯状细胞消失图3 各组大鼠直肠变化(HE染色 主图×200,右上角小图×40)

表5 照射后第4、7、10天各组直肠Hovdenak评分变化 分

2.5 各组大鼠血清COX-2、TNF-α、IL-6、Hsp90α水平的比较

对照组大鼠腹主动脉血清COX-2、TNF-α、IL-6、Hsp90α水平均低于模型组及高剂量组,而高剂量组低于模型组,组间差异均有统计学意义(P<0.01),见图4。

3 讨 论

腹盆腔肿瘤在放射性治疗时,常会对肠道等邻近非肿瘤组织造成损伤,且这些损伤往往是不可避免的,从而导致RE等严重并发症[12]。RE的发生与照射剂量、照射方式、是否联合化疗、是否有合并症等密切相关,如患者合并高血压、糖尿病、慢性炎症性肠病、系统性红斑狼疮等疾病时,往往会增加放疗肠道毒性[1]。临床主要表现为恶心呕吐、腹痛腹泻、便血等,长期甚至可出现梗阻、脓肿、穿孔、瘘管等并发症[13]。目前主要结合临床表现、病史,通过CT肠造影术或磁共振的横断面成像及内镜等辅助检查来确诊;治疗策略主要是缓解症状和处理新出现的并发症。临床缺乏系统、标准化的诊治方案[14]。

中医上将RE归属于“泄泻”“便血”等范畴,类似肠风、脏毒等病。其病因为原发恶性肿瘤疾病的致病根本,即正气虚亏、脏腑失调,加之放射线照射,外感热毒,引动内生癌毒、邪热入血,虚实夹杂,痰湿淤毒阻塞肠腑,导致本病[3,15]。针对RE基本病机,沈伟生名中医自拟清化凉血护络汤应用于临床,方中白芍养血缓急柔肠、增加应激能力为君药;黄柏、苍术化浊、清下焦湿热为臣药;紫草、红景天、地榆、仙鹤草具凉血通络、护络收敛、防血溢之效,且红景天经现代药理研究具有提高放射阈的作用,共为佐药;败酱草、老鹳草、大血藤、马齿苋善清下焦热毒、防泻痢共为使药。

RE的发病机制目前仍不明确,大多学者认为快速分裂的肠上皮,特别是对辐射高度敏感的隐窝干细胞,直接暴露于辐射产生了的细胞毒性效应,导致了细胞凋亡、肠道黏膜屏障结构及功能发生损害;过程中产生的活性氧、激活促炎细胞因子、趋化因子和生长因子,如COX-2、TNF-α、IL-6等,招募免疫细胞,造成炎症风暴[16-18],从而导致了RE的发生。NO作为重要的炎症介质及氧自由基,在RE的发生发展中也担任了不可或缺的角色。电离辐射后,NO合酶活性增强,从而诱导产生大量的NO,通过介导炎症反应、抑制cAMP生成、过氧化等作用导致细胞能量代谢受损,DNA、蛋白质等大分子物质合成障碍[19-20]。Hsp90α在非应激状态下占细胞蛋白质的1%～2%,在应激状态下高达4%～6%[21],同时正向调节NO的合成[22],可参与炎症、细胞凋亡等过程,造成肠组织损伤。最近研究表明供应肠道的微血管内皮细胞的损伤、肠道菌群改变也可能是RE产生的原因[23]。

本实验采用电离辐射大鼠腹部模拟急性RE,模型组大鼠出现摄食、饮水量减少及体重下降等症状,镜下可见肠绒毛厚度及隐窝深度变浅,伴水肿和炎症细胞浸润,少量绒毛上皮细胞脱落及凋亡,血清中COX-2、TNF-α、IL-6等含量增加,提示急性RE大鼠模型构建成功。通过记录大鼠每日粪便形态、肛周皮毛及精神状态,电镜下观察肠黏膜改变包括肠腺存活率、绒毛高度、隐窝深度,测定大鼠腹主动脉血清中炎症因子含量来探讨清化凉血护络汤预防大鼠RE的疗效及其可能机制。结果显示,清化凉血护络汤能有效预防大鼠急性RE,显著改善大鼠腹泻、精神萎靡等症状,较好地维持大鼠肠黏膜结构及功能完整性,且其效果与给药浓度有关,药物浓度高对肠黏膜保护作用更强。清化凉血护络汤可以降低COX-2、TNF-α、IL-6、NO、Hsp90α等炎症因子及介质,进而抑制炎症反应,减少上皮细胞凋亡,维持细胞间紧密完整性,稳定肠黏膜机械屏障,这些可能是其预防RE的机制所在。本研究结果可为清化凉血护络汤应用于RE的临床预防及治疗提供基础数据。