血浆中ZNF582甲基化在结直肠癌早期诊断中的可行性研究

戴彦苗,彭惠平,王杰,夏晨静,高黎明,徐宏伟

(昆山市中医医院 脾胃肝胆科,江苏 昆山 215300)

根据国家肿瘤中心发布的最新中国癌症统计数据,结直肠癌新发病例数已经上升至所有癌症中的第2位(40.8万),死亡人数已经上升至所有癌症中的第4位(19.6万),自2000年以来的统计数据发现结直肠癌发病率和死亡率一直呈增长趋势[1]。结直肠癌在癌前病变阶段进行干预的5年生存率约为100%,在癌症早期阶段进行干预的5年生存率高达90%,而当结直肠癌发展到Ⅳ期时的5年生存率骤降至14%[2]。当前我国Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期和未知分期结直肠癌的诊治比例分别为3.5%、29.2%、29.8%、16.3%和11.2%[3]。因此,实现结直肠癌早期筛查进而进行早期干预,对于降低结直肠癌的发病率和死亡率具有重要意义。

结直肠癌筛查的金标准为结肠镜,但是其是一种侵入性的检查方法,痛苦较大且侵犯隐私,整体的依从率较低。且在中国这样的发展中国家,医疗资源有限,结肠镜难以作为结直肠癌初筛的手段[4]。亚太地区结直肠肿瘤预测评分标准是2014年亚太结直肠癌筛查会议中提出的一种共识方法,该方法是一种有效的对亚太地区无症状人群结直肠癌初筛手段[5],目前已经在我国的结直肠癌初筛工作中广泛应用,但是其存在灵敏度低和特异性差的问题[6]。免疫法粪便潜血试验(fecal immunochemical test,FIT)是一种结直肠癌筛查中常用的非侵入性的检查手段,其对结直肠癌具有较高的灵敏度,但是对非进展期腺瘤等癌前病变的灵敏度相对较低。DNA甲基化是与癌症发生高度相关的表观遗传修饰,癌症组织中释放的游离DNA携带的甲基化信息进入血液或粪便后,检测血液或粪便样本中DNA甲基化水平变化可以成为一种有效的结直肠癌非侵入性早期诊断方法,且该方法相对于传统的问卷法和FIT,具有灵敏度高和特异性强的优势,已经逐渐被纳入各国的最新结直肠癌筛查指南[7-8]。锌指蛋白582(zincfingerprotein582,ZNF582)位于人的19号染色体,含有1个KRAB-A-B结构域和9个锌指模型[9]。ZNF582启动子区域甲基化被发现与宫颈癌及食管鳞癌的发病有显著相关性[10-11],且有研究发现其在结直肠癌组织中的甲基化水平也存在异常[9],但是ZNF582在血浆样本的甲基化水平及其作为一种非侵入性的检测标志物在结直肠癌早期诊断中应用价值研究却鲜有报道。因此,本研究探讨血浆中ZNF582甲基化的检测用于结直肠癌早期诊断的可行性。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2021年1月1日至2022年6月30日,在昆山市中医医院进行结肠镜检查的患者。其中确诊为结直肠癌患者78例(结肠癌组),包含Ⅰ期10例、Ⅱ期24例、Ⅲ期23例、Ⅳ期8例、未知分期13例;男50例,女28例,平均年龄为63岁。结直肠息肉患者62例(结直肠息肉组),其中男34例,女28例,年龄31～81岁,平均59岁。另选结肠镜检查正常者83例为正常对照组,其中男34例,女49例,年龄23～79岁,平均49岁。所有结直肠癌和结直肠息肉患者均经病理确诊。

1.2 血浆ZNF582甲基化检测

使用10 ml BD Vacutainer®K2E(EDTA)采血管采集10 ml静脉外周血,经1 350×g离心2次后分离出3.5 ml血浆。使用苏州唯善生物科技有限公司的甲基化检测样本前处理试剂盒提取3.5 ml血浆中游离DNA并对血浆游离DNA进行亚硫酸盐转化和纯化。纯化后的DNA使用100 μl洗脱液洗脱,放置于-20 ℃保存。血浆中ZNF582甲基化检测使用苏州唯善生物科技有限公司的ZNF582甲基化检测试剂盒,该试剂盒中包含1组ZNF582甲基化特异性引物和Taqman探针,同时检测1个人源内参基因β-Actin(ACTB),当ACTB的Ct值<35时判定为样本量足够,否则为无效样本。检测时,取15 μl 游离DNA样本加入15 μl PCR反应混合液中,随后放入ABI7500荧光定量PCR仪中进行反应。具体反应条件为:95 ℃热启动20 min;95 ℃变性10 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸10 s,共50个循环;40 ℃降温1 min。以甲基化ZNF582的Ct值代表其甲基化水平,Ct值越低则甲基化水平越高。

1.3 统计学处理

使用Windows SPSS 22.0软件进行统计学分析,P<0.05为差异具有统计学意义。采用MedCalc软件绘制ROC曲线,以结肠镜和病理检查结果为金标准,计算各检测方法的灵敏度和特异性。

2 结 果

2.1 血浆中的ZNF582甲基化水平

结直肠癌组患者血浆中的ZNF582甲基化水平显著高于结直肠息肉组和正常对照组(P<0.000 1),而结直肠息肉组血浆中的ZNF582甲基化水平也显著高于正常对照组(P<0.000 1),见图1。

图1 血浆样本中ZNF582甲基化水平

2.2 ZNF582甲基化诊断结直肠癌ROC曲线

ZNF582甲基化诊断结直肠癌的ROC曲线AUC值为0.879(95%CI0.818 ～0.925),约登指数最大值(0.634 4)所在的Ct值为35.7,对应的灵敏度和特异性分别为73.1%和90.4%,见图2。根据ROC曲线所得到的最佳Cut-off值,对后续的数据进行进一步的分析。

图2 血浆ZNF582甲基化诊断结直肠癌的ROC曲线

2.3 血浆ZNF582甲基化对结直肠癌的诊断效果

根据ROC曲线得到的Cut-off值(Ct值<35.7),对结直肠癌、结直肠息肉和正常样本进行分析后发现,血浆中ZNF582甲基化对结直肠息肉的灵敏度为37.1%,对结直肠癌的灵敏度为73.1%,在正常对照中的检出率为9.6%(对应特异性为90.4%)(图3A)。ZNF582甲基化对不同分期的结直肠癌诊断效果具体分析发现,对Ⅰ期结直肠癌的灵敏度可达90%,对Ⅱ期结直肠癌的灵敏度为79.2%,对Ⅲ期结直肠癌的灵敏度为60.9%,对Ⅳ期结直肠癌的灵敏度为100.0%,对未知分期的结直肠癌灵敏度为53.8%(图3B)。进一步对结直肠癌根据不同特征进行分组分析后发现,血浆中ZNF582甲基化对不同性别、分期、分化程度以及肿瘤大小的结直肠癌检测灵敏度无显著差异,但是对不同年龄的结直肠癌检测灵敏度有显著差异(P<0.05),见表1。

图3 血浆ZNF582甲基化对结直肠息肉和结直肠癌样诊断的灵敏度与特异性(A)和ZNF582甲基化在不同癌症分期的灵敏度(B)

表1 血浆ZNF582甲基化对不同分组结直肠癌样本检测的灵敏度差异

3 讨 论

结直肠癌是威胁人类健康最常见的恶性肿瘤之一,当前在我国呈现发病率逐年升高和逐渐年轻化的趋势[1]。因此,实现结直肠癌的早期诊断和早期干预是降低结直肠癌发病率和死亡率的重要手段。DNA甲基化是哺乳动物中最常见的表观遗传修饰,主要发生在基因的启动子区域,当基因的启动子区域甲基化水平异常时,通常会导致抑癌基因或原癌基因的表达水平发生变化,从而导致癌症的发生。因此,DNA甲基化被认为是一种潜在有效的癌症早期诊断和预后生物标志物[12]。

当前,使用血浆或粪便中DNA甲基化作为结直肠癌早期诊断的标志物已经在临床上得到了成功应用[13]。例如,血浆的SEPT9甲基化已经被美国食品药品监督管理局(FDA)和国家药品监督管理局(NMPA)批准用于结直肠癌的辅助诊断,其对结直肠腺瘤和结直肠癌的灵敏度为10%～22%和68%～77%,特异性达80%～96%[14-15]。SDC2甲基化是另一个被NMPA批准用于结直肠癌辅助诊断的标志物,其在粪便样本中对进展期腺瘤及结直肠癌的灵敏度可以达到42%和84%,特异性达98%[16]。

ZNF582与维持细胞凋亡、细胞分化、肿瘤转化和细胞周期控制密切相关[17], 最近的研究也表明,启动子中的甲基化ZNF582是癌症沉默的重要表观遗传机制[18]。高官壮等[9]探索了ZNF582基因启动子区在结直肠癌组织中的甲基化状态,发现其在结直肠癌组织中的甲基化水平显著高于癌旁组织。但是针对血浆中的ZNF582甲基化水平的研究及其用于结直肠癌早期诊断的可行性探索却鲜有报道。血浆中的循环肿瘤DNA(circulatingtumor DNA, ctDNA)来源于肿瘤组织凋亡或坏死所产生的DNA片段,因此在血浆中的ctDNA浓度非常低且在检测时存在极大的挑战性。本研究对血浆中ZNF582的甲基化水平进行了探索性的检测尝试,通过高灵敏度的甲基化特异性荧光定量PCR可以有效地检测到血浆中ctDNA所携带的ZNF582甲基化信息,且ZNF582在结直肠癌血浆中的甲基化水平显著高于其在正常对照中甲基化水平。根据ROC曲线分析发现,血浆中的ZNF582甲基化可以显著区分结直肠癌和正常人群,具有较高的灵敏度和特异性。与此同时,对不同分期的结直肠癌样本分析发现,ZNF582在Ⅰ期肠癌中的甲基化水平达到了90%,这比血浆中SEPT9甲基化在Ⅰ期肠癌中仅有不足50%的灵敏度要高出很多。因此血浆中的ZNF582甲基化是一种潜在的有效的非侵入性结直肠癌早期诊断标志物。另外,与粪便样本采集对比,血浆样本具有高通量、易均一化处理的优势,在大规模人群体检及筛查时应用更为方便。虽然血浆样本中的游离DNA量远少于粪便样本,但是本研究结果显示,血浆中ZNF582甲基化对结直肠癌的检测灵敏度与粪便中SDC2甲基化差异仅有约10%,且血浆ZNF582甲基化在Ⅰ期结直肠癌的灵敏度上更具优势(90%vs.87%),以上数据也反映出血浆ZNF582甲基化是一种操作简便且高效的结直肠癌早期诊断方法。

本研究还存在一些不足,纳入的样本数量有限,且为单研究中心的病例对照研究,因此在检测结果上可能存在一些偏倚性。在未来希望可以纳入更多的样本,展开多中心的前瞻性研究,深入地探索血浆中ZNF582甲基化用于结直肠癌早期诊断的临床效果。

综上所述,血浆中ZNF582甲基化在结直肠癌诊断中具有较高的灵敏度和特异性,可以作为一种潜在的新型结直肠癌早期诊断的替代性方法。