miRNA-27与宫颈癌细胞线粒体凋亡途径的相关性△

王茜，雷正瑶，王顺利，莫琼华，易祥华,3，蒋铭华

1上海市金山区亭林医院病理科，上海 201505

2同济大学附属同济医院病理科，上海 200065

3新疆临床基因检测与生物医学信息重点实验室，新疆 克拉玛依 834000

4复旦大学附属闵行医院/上海市闵行区中心医院妇产科，上海 201100

宫颈癌是世界范围内病死率前五位的恶性肿瘤[1]，其发病率呈持续上升趋势[2]，在中国宫颈癌发病例数也不断增多[3]。宫颈癌是女性肿瘤死亡的重要原因，持续的人乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染是导致宫颈癌的重要原因，除HPV 感染外，包括微小RNA（microRNA，miRNA）在内的遗传和表观遗传因素也参与了宫颈癌的发生。miRNA 与宫颈癌的侵袭、转移具有密切关系，其在宫颈癌中的作用日益受到重视[4]。从功能和机制的角度来看，miRNA 已被明确在宫颈癌的诊断、治疗和预后评估中具有一定作用，但还需要更全面的临床试验来实现基于miRNA 的诊断和治疗方法的临床转化[5]。目前的研究普遍认为miRNA-27 在宫颈癌中表达升高，且与宫颈癌的发生发展密切相关[6]，靶向miRNA-27 能够抑制宫颈癌进展[7]，但具体机制尚不完全明确。研究表明，miRNA 能够调控人体约1/3 的基因，在调控肿瘤细胞凋亡的过程中起着重要甚至关键作用，因此成为临床研究热点。miRNA-27 与细胞凋亡也存在一定的关系[8]，其潜在靶点LETM1 结构域蛋白1（LETM1 domain containing 1，LETMD1）是线粒体外膜的结构蛋白组成之一[9]，在宫颈癌中的相关研究尚不充足。本研究分析miRNA-27 与宫颈癌细胞线粒体凋亡途径的关系，探讨miRNA-27 在宫颈癌中的作用网络和机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

宫颈癌SiHa 细胞株购自美国模式菌种收集中心（American Type Culture Collection，ATCC），RPMI1640 培养基购自生工生物工程（上海）股份有限公司，顺铂购自上海碧云天生物技术有限公司，Trizol、miRNA荧光定量检测试剂盒均购自Takara公司，miRNA 互补DNA（complementary DNA，cDNA）合成试剂盒、mRNA cDNA合成试剂盒分别购自生工生物工程（上海）股份有限公司和Taraka公司，所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 miRNA-27 成熟体检测及表达分析

通过检索miRBase 数据库[10]鉴定miRNA-27 的成熟体序列，通过miRNA 相关肿瘤生物信息Oncomir 数据库[11]分析其在宫颈癌中的表达情况。

1.3 miRNA-27 相关靶基因分析

通过检索常用的miRNA 数据库miRDB、Targetscan7.2 和ENCORI[12-14]预测miRNA-27 的4 种成熟体的可能靶基因。将全部可能靶基因纳入DAVID[15]分析工具，进行基因本体（gene ontology，GO）与京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信号通路富集分析，结合GeneMANIA 数据库筛选与线粒体凋亡途径直接相关的基因，并通过ENCORI 数据库验证所选基因与miRNA-27 表达的相关性。

1.4 构建细胞凋亡模型

以参考文献[16]为依据，通过顺铂诱导构建宫颈癌细胞SiHa 凋亡模型（顺铂组），主要步骤如下：采用RPMI 1640 完全培养基（含10%胎牛血清）常规培养宫颈癌SiHa 细胞株，并置于37 ℃、5%CO2培养箱中，实验前24 h 将细胞接种于6 孔板中，随后更换为含有5 μmol/L 顺铂的培养基（提前配置），细胞继续常规条件孵育24 h 后进行后续检测；以无顺铂干预的细胞为空白对照组。

1.5 荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）检测靶基因表达情况

将体外6 孔培养板中的细胞经无菌磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）清洗后，每孔用1 ml Trizol 裂解消化细胞，加入200 μl 氯仿振荡混匀后，12 000 r/min、4 ℃离心15 min，转移上层水相至新离心管后加入0.5 ml 异丙醇沉淀RNA 并再次12 000 r/min、4 ℃离心15 min，随后加入1 ml 75%乙醇温和清洗沉淀，8000 r/min、4 ℃离心5 min后收集总RNA，进一步通过polyA 加尾法逆转录合成miRNA cDNA 第一链，将稀释后的cDNA 通过荧光定量PCR 试剂盒进行荧光定量PCR 反应，检测靶基因的表达情况，所有操作均按照试剂盒说明书进行。miRNA-27 分析以U6为内参，U6上游引物5'-GCTTCGGCAGCACATATACT-3'，下游引物5'-GCTTCACGAATTTGCGTGTC-3'；miRNA-27 上 游引物为其自身序列（miRNA-27a-3p：5'-TTCACAGTGGCTAAGTTCCGC-3'；miRNA-27a-5p：5'-AGGGCTTAGCTGCTTGTGAGCA-3'；miRNA-27b-3p：5'-TTCACAGTGGCTAAGTTCTGC-3'；miRNA-27b-5p：5'-AGAGCTTAGCTGATTGGTGAAC-3'），下游引物5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。LETMD1分析以β-actin为内参，β-actin上游引物5'-GTTGTCGACGACGAGCG- 3'，下游引物 5'- GCACAGAGCCTCGCCTT-3'；LETMD1上游引物5'-CGTCATTTCCCCCGCTTCTA- 3'，下游引物5'-GCATCAGCCCATAACATCTGC-3'。

1.6 统计学分析

采用GraphPad 9.0 软件对数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（）表示，组间比较采用t检验；以P﹤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miRNA-27的成熟体序列及在宫颈癌中的表达

通过miRBase 生物信息数据库检索分析miRNA-27，发现hsa-miRNA-27 存在4 种成熟体hsamiRNA-27a-3p、hsa-miRNA-27a-5p、hsa-miRNA-27b-3p 和hsa-miRNA-27b-5p（表1）。随后进一步在Oncomir 数据库中分析这4 种成熟体的表达情况发现，在不同肿瘤中miRNA-27 存在不同的表达水平，在宫颈癌中miRNA-27 不同成熟体也存在不同的表达水平，其中hsa-miRNA-27a-3p 与hsa-miRNA-27b-3p 的表达水平明显高于hsa-miRNA-27a-5p 和hsa-miRNA-27b-5p（图1）。

图1 Oncomir数据库中miRNA-27在不同肿瘤中的表达情况

表1 miRNA-27 的成熟体序列

2.2 miRNA-27 靶基因的生物信息分析

通过miRDB、Targetscan7.2 和ENCORI 数据库分析miRNA-27 的4 种成熟体可能的靶基因，整合上述数据库靶基因数据并通过DAVID 进行GO 和KEGG 信号通路分析。KEGG 信号通路富集分析显示，miRNA-27 的靶基因主要参与肿瘤的信号通路，这些通路与细胞凋亡均存在密切关系；GO 功能富集分析发现，miRNA-27 与线粒体外膜相关。（图2）

图2 miRNA-27靶基因GO和KEGG通路富集分析

2.3 线粒体途径凋亡相关基因

DAVID 生物信息分析结果显示，miRNA-27 的靶基因中有部分基因与线粒体外膜相关，可能与线粒体途径的凋亡存在密切关系，其中包括LETMD1、酰基辅酶A 合成酶长链家族成员6（acyl-CoA synthetase long chain family member 6，ACSL6）、肉碱棕榈酰转移酶1B（carnitine palmitoyltransferase 1B，CPT1B）等。（图3）

图3 线粒体途径凋亡相关的miRNA-27的靶基因（GeneMANIA数据库）

2.4 miRNA-27 与LETMD1 的相关性

通过miRNA-Target CoExpression 生物信息分析发现，miRNA-27 的4 种成熟体中miRNA-27a-3p、miRNA-27a-5p 与LETMD1 共表达存在相关性（P﹤0.05），miRNA-27b-3p、miRNA-27b-5p 与LETMD1 共表达无相关性（P﹥0.05）。（表2）

表2 miRNA-27 的4 种成熟体与LETMD1 在宫颈癌中的共表达情况（ENCORI 数据库）

2.5 miRNA-27a 和LETMD1 mRNA 相对表达量的比较

在上述结果的基础上，进一步通过宫颈癌细胞凋亡模型验证miRNA-27a-3p、miRNA-27a-5p 和LETMD1 的表达情况。结果发现，顺铂组中miRNA-27a-3p 和miRNA-27a-5p 相对表达量均低于空白对照组，LETMD1mRNA 相对表达量高于空白对照组，差异均有统计学意义（P﹤0.05）。（表3）

表3 不同组别SiHa细胞中miRNA-27a与LETMD1 mRNA相对表达量的比较

表3 不同组别SiHa细胞中miRNA-27a与LETMD1 mRNA相对表达量的比较

组别空白对照组顺铂组t值P值miRNA-27a-3p 1.00±0.05 0.45±0.01 10.740<0.01 miRNA-27a-5p 1.00±0.13 0.63±0.01 2.902<0.05 LETMD1 mRNA 1.00±0.10 2.07±0.33 3.109<0.05

3 讨论

在过去的几十年中，miRNA 作为与人类和其他生物基因表达调控相关的重要分子，为疾病的诊断和治疗提供了很多可用策略[17]。研究miRNA的分子作用机制有助于开发基于miRNA 的宫颈癌治疗策略，弥补现有治疗方案的不足。miRNA 作为与宫颈癌发生发展相关的生物分子，有助于病变的早期诊断[18]。

研究显示，miRNA-27 与宫颈病变的恶性程度密切相关，存在多样化作用方式，例如miRNA-27a可以通过靶向其下游分子调控宫颈癌细胞的恶性生物学行为[19]，miRNA-27b 可通过作用于长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）AFAP1 反义RNA 1（AFAP1 antisense RNA 1，AFAP1-AS1）/miRNA-27b-3p/血管内皮生长因子C（vascular endothelial growth factor C，VEGFC）信号通路调控宫颈癌干细胞的状态[20]，miRNA-27b 可影响宫颈癌细胞上皮-间充质转化[21]。宫颈癌发生发展中一个非常重要的机制是基因调控失常导致肿瘤细胞增殖和凋亡的改变、失衡，miRNA-27 与肿瘤细胞凋亡存在密切关系[22]。据报道，在伴有HPV16 和HPV52 感染的宫颈癌及宫颈鳞状上皮内病变患者中，miRNA-27b 表达水平升高，而在伴有HPV58 感染的宫颈癌及宫颈鳞状上皮内病变患者中，miRNA-27b 的表达水平下调[23]；HPV16 E7 可通过促进miRNA-27b 表达上调，抑制下游分子过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ）的表达，促进宫颈癌细胞增殖、侵袭[24]；LINC01089 可通过调控miRNA-27a抑制宫颈癌细胞增殖[25]；lncRNA TOB1 反 义RNA1（TOB1 antisense RNA 1，TOB1-AS1）也可通过影响miRNA-27b 的表达调控宫颈癌细胞增殖、凋亡[26]。这些研究结果表明，宫颈癌细胞凋亡是宫颈癌发生发展过程中的重要机制之一。

基于细胞凋亡在宫颈癌中的重要作用，了解肿瘤细胞凋亡成为研究宫颈癌的基本思路之一，但目前的研究仍未能全面阐明细胞凋亡在宫颈癌中的作用机制，尤其是miRNA-27 通过何种机制参与宫颈癌细胞凋亡目前仍未完全清楚。本研究通过Oncomir 数据库分析发现，miRNA-27 不同的成熟体在宫颈癌中表达水平有所差异，进一步分析其潜在的靶基因及生物学功能、信号通路等发现，miRNA-27 涉及复杂的生物学功能改变，其中包含细胞凋亡这一重要的生物学功能，提示宫颈癌细胞凋亡与miRNA-27 存在关联。进一步的生物信息学分析筛查出与线粒体途径凋亡最直接相关的靶基因，并选取与宫颈癌关系密切的LETMD1 进行了后续验证。

研究表明，LETMD1在宫颈癌、胃癌等恶性肿瘤中高表达，是肿瘤相关基因之一[27-28]。在细胞功能方面，LETMD1是线粒体外膜的结构蛋白组成之一[16]，因此在线粒体途径凋亡方面具有重要作用，LETMD1 可以通过调控凋亡相关蛋白B 细胞淋巴瘤/白血病2 相关X 蛋白的表达参与乳腺癌细胞凋亡[29]。同时，LETMD1 在宫颈癌中可经由上游分子调控其表达，从而影响其功能。研究显示，核仁小分子RNA 宿主基因1（small nucleolar RNA host gene 1，SNHG1）/miRNA-194 信号通路可调控LETMD1 的表达，进而影响宫颈癌细胞凋亡、增殖等[30]。虽然miRNA-27 与LETMD1 均与细胞凋亡相关，但二者的关系及在宫颈癌中的作用仍有待明确，目前尚无文献报道。本研究通过ENCORI 数据库分析发现，miRNA-27 与LETMD1 存在共表达相关性，主要与miRNA-27 的成熟体miRNA-27a-3p 和miRNA-27a-5p 相关，进一步在宫颈癌细胞SiHa 凋亡模型中发现，miRNA-27a-3p、miRNA-27a-5p和LETMD1存在不同程度表达改变，顺铂组中miRNA-27a-3p 和miRNA-27a-5p相对表达量均低于空白对照组，LETMD1mRNA相对表达量高于空白对照组，差异均有统计学意义（P﹤0.05）。提示miRNA-27 与宫颈癌细胞线粒体凋亡途径的相关性与LETMD1 密切相关。究其原因，一方面LETMD1 可能是miRNA-27的潜在作用靶点，另一方面二者均参与宫颈癌细胞凋亡过程，因此二者的共同表达、共同作用很可能是调控宫颈癌细胞线粒体凋亡途径的重要因素。

综上所述，本研究利用生物信息学方法对miRNA-27 的表达、功能、潜在靶基因进行了分析，发现miRNA-27 与LETMD1 可能存在相关性，提示生物信息学分析在探索宫颈癌发病机制方面具有一定的作用，可以为后续进一步研究提供有价值的研究方向及理论支撑，进一步发掘更深入的机制。