非小细胞肺癌患者的血浆miRNA-150水平与临床特征和血清癌胚抗原水平的关系△

关英，隆玉萍，翟志英

西宁市第一人民医院呼吸内科，西宁 810003

非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是全球恶性肿瘤相关死亡的主要原因之一。多数NSCLC 患者确诊时已为局部晚期或已发生转移，其总体预后较差。NSCLC 患者采取手术切除或根治性放疗后具有相对良好的长期预后[1]。早诊早治是提高NSCLC 患者生存率和改善预后的关键。研究表明，CT 筛查周期差异大、假阳性率高且效益成本比低，血清肿瘤标志物被认为是早期诊断NSCLC 的有效手段[2]。癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）是广谱血清肿瘤标志物，参与NSCLC 的发生发展过程，其表达水平可反映病变程度，可作为有前景的肿瘤标志物用于NSCLC 的诊断及病情评估，具有较好的特异度，但其诊断准确度及灵敏度均较低，漏诊率和误诊率均较高[3-4]。新兴的生物标志物检测在NSCLC 的筛查中具有一定的潜力。微小RNA（microRNA，miRNA）可作为信使在细胞间传递信息并参与肿瘤发展，可能是多种疾病非侵入性、敏感的潜在诊断标志物，特别是在恶性肿瘤领域[5-6]。miRNA-150是一种重要的造血细胞特异性miRNA，主要在B细胞、T 细胞和自然杀伤细胞中表达，在某些造血细胞系的分化过程中起着重要作用，特别是在淋巴细胞的发育过程中。研究表明，miRNA-150 在不同实体瘤中可作为致癌基因或抑癌基因发挥作用[7-8]。本研究探讨NSCLC 患者的血浆miRNA-150水平与临床特征和血清CEA 水平的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2020年5月至2022年5月西宁市第一人民医院收治的NSCLC患者。纳入标准：①经病理检查确诊为NSCLC；②接受手术切除治疗；③年龄≥18岁；④临床资料完整。排除标准：①合并心、肾、肺等重要脏器功能不全；②合并其他恶性肿瘤。依据纳入和排除标准，本研究共纳入96 例NSCLC 患者作为NSCLC 组，其中，男57 例，女39 例；年龄27～76 岁，平均（65.23±11.32）岁。另选取同期西宁市第一人民医院收治的肺部良性疾病患者80 例作为对照组，其中男42 例，女38 例；年龄31～75 岁，平均（64.86±10.38）岁。两组患者的性别、年龄比较，差异均无统计学意义（P﹥0.05），具有可比性。本研究经医院伦理委员会审批通过，所有患者均知情同意。

1.2 检测方法

1.2.1 样本采集 分别收集两组患者的肘静脉血5 ml，分为两份，分别置于枸橼酸钠抗凝管和未加抗凝剂的试管中。枸橼酸钠抗凝管中的样本3000 r/min 离心10 min，留取血浆，于-80 ℃冰箱中保存。未加抗凝剂的试管，室温静置1 h，3500 r/min离心10 min，留取血清。

1.2.2 血浆miRNA-150 水平检测 检测时解冻血浆，按照德国Qiagen 公司的miRNeasy 试剂盒说明书提取血浆总RNA，使用UV-2800 紫外分光光度仪测定其浓度及纯度。采用逆转录试剂盒通过逆转录合成互补DNA（complementary DNA，cDNA），再进行实时荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）。PCR 反应体系：SYBR 荧光染料混合液12.5 μl，逆转录产物2.5 μl，上游引物和下游引物各1.5 μl，ROX 校正染料Ⅱ0.05 μl，无RNA 酶水6.95 μl。PCR 条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40 个循环。以U6作为内参基因，采用2-ΔΔCt法计算miRNA-150 的相对表达量。miRNA-150 正向引物5'-GGGTCTCCCAACCCTTGTA-3'，反向引物5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'；U6正向引物5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，反向引物5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。重复测量3 次，取平均值。

1.2.3 血清CEA 水平检测 取血清，采用电化学发光法检测血清CEA 水平，试剂盒购自北京华科泰生物技术有限公司，具体操作根据试剂盒说明书进行。CEA 正常参考值：﹤5 μg/L。

1.3 观察指标

比较NSCLC组和对照组患者的血浆miRNA-150和血清CEA 水平。比较不同临床特征NSCLC 患者的血浆miRNA-150 水平。分析NSCLC 患者血浆miRNA-150 水平与血清CEA 水平的相关性。分析miRNA-150、CEA 单独及联合检测对NSCLC 的诊断效能。

1.4 统计学分析

采用SPSS 22.0 软件对数据进行统计分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示，组间比较采用t检验。计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验或Fisher 确切概率法。NSCLC 患者血浆miRNA-150 水平与血清CEA 水平的相关性采用Pearson 相关分析。绘制受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线分析miRNA-150、CEA 单独及联合检测对NSCLC 的诊断效能，计算曲线下面积（area under the curve，AUC）。以P﹤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血浆miRNA-150 和血清CEA 水平的比较

NSCLC 组患者的血浆miRNA-150 和血清CEA水平均明显高于对照组，差异均有统计学意义（P﹤0.01）。（表1）

表1 两组患者血浆miRNA-150 和血清CEA 水平的比较

表1 两组患者血浆miRNA-150 和血清CEA 水平的比较

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2.2 不同临床特征NSCLC 患者血浆miRNA-150水平的比较

不同性别、年龄、吸烟史、组织学类型、临床分期、分化程度、肿瘤直径NSCLC 患者的血浆miRNA-150 水平比较，差异均无统计学意义（P﹥0.05）。（表2）

表2 不同临床特征NSCLC 患者血浆miRNA-150 水平的比较

2.3 血浆miRNA-150水平与血清CEA水平的相关性

Pearson 相关分析结果显示，NSCLC 患者的血浆miRNA-150 水平与血清CEA 水平呈正相关（r=0.726，P=0.016）。

2.4 miRNA-150、CEA单独及联合检测对NSCLC的诊断效能

miRNA-150、CEA联合检测诊断NSCLC 的AUC、灵敏度及特异度分别为0.986、93.1%、100%，均高于miRNA-150、CEA 单独检测。（表3）

表3 miRNA-150、CEA 单独及联合检测对NSCLC 的诊断效能

3 讨论

NSCLC 是一种实体瘤，由于早期缺乏特异性症状，常在晚期确诊，导致手术治疗机会较少。探索早期诊断及治疗NSCLC 的有效方式，是延长患者生存期、改善患者预后的关键。肿瘤标志物检测具有经济、有效、简便及可重复性高等特点，但存在灵敏度低或特异度不足等问题，不能有效用于NSCLC 的早期诊断。

miRNA 是一种长度约22 个核苷酸的非编码小分子RNA，通过与靶标mRNA 的3'-非翻译区（3'-untranslated region，3'-UTR）序列特异性结合调节基因表达。miRNA 参与调控多种生物过程，包括细胞增殖、凋亡、分化和信号转导。每一个miRNA都能靶向调控数百个mRNA，其表达水平的任何变化都可能对生物过程产生重大影响，导致病理生理改变。通过对各种人类恶性肿瘤和217 种哺乳动物的miRNA 进行系统分析，发现miRNA 谱具有惊人的信息量，反映了肿瘤的发展谱系和分化状态。肿瘤微环境通过细胞外泌体高度参与肿瘤细胞的代谢重组，促进营养物质的完全利用，有利于脂质和谷氨酰胺的氧化磷酸化，损害了糖酵解，从而使微环境从正常状态转变为肿瘤有利状态，为肿瘤生长、侵袭和耐药提供了条件。越来越多的证据表明，外泌体miRNA 对改变肺癌微环境具有至关重要的作用，可能在NSCLC 细胞的免疫逃逸、化疗药物耐药和生物学功能等方面发挥作用[9]。因此，miRNA 有可能作为一种有前景的非侵入性生物标志物和潜在靶标应用于NSCLC 的诊断和治疗。研究表明，miRNA-148a 通过靶向WNT1 抑制肿瘤细胞迁移和侵袭，并且miRNA-148a 低表达与NSCLC 的分化程度、淋巴结转移情况和肿瘤相关死亡风险密切相关[10]。miRNA-4286 能够通过靶向核输出蛋白1 调节凋亡通路，从而降低NSCLC 细胞对顺铂的敏感性[11]。miRNA-300 可通过下调E26转录因子1（E26 transformation specific 1，ETS1）的表达抑制NSCLC 细胞增殖、迁移和侵袭，从而抑制NSCLC 的进展[12]。

miRNA-150 位于人类染色体19q13 上，其异常表达与恶性肿瘤的发生发展有关。研究表明，miRNA-150 在多种恶性肿瘤中具有促癌作用，miRNA-150 可通过与叉头框蛋白O4（forkhead box O4，FOXO4）mRNA 的3'-UTR 结合，诱导FOXO4转录阻滞，促进宫颈癌细胞生存和细胞周期进展[6]。miRNA-150 以肿瘤融合抑制因子（suppressor of fused homolog，SUFU）为靶点，通过Hedgehog 和WNT 信号的双重激活，促进胃癌细胞增殖、迁移和上皮-间充质转化[7]。另有研究表明，miRNA-150 可能作为抑癌基因，通过下调黏蛋白4（mucin 4，MUC4）的表达阻断人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）及其下游黏着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）和胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinas，ERK）信号通路，从而抑制胰腺癌细胞生长及恶性行为特性[13]。因此，miRNA-150 作为癌基因还是抑癌基因取决于肿瘤类型。

本研究结果显示，NSCLC 组患者的血浆miRNA-150 水平明显高于对照组，说明miRNA-150 在NSCLC 患者的血浆中呈高表达，可能在NSCLC 中发挥致癌基因的作用。本研究分析血浆miRNA-150 水平与NSCLC 患者临床特征的关系，结果发现，不同性别、年龄、吸烟史、组织学类型、临床分期、分化程度、肿瘤直径NSCLC 患者的血浆miRNA-150 水平比较，差异均无统计学意义（P﹥0.05），与既往研究报道的结果一致[14]。说明NSCLC 患者血浆miRNA-150 水平不受临床特征影响。本研究的Pearson 相关性分析结果显示，NSCLC 患者的血浆miRNA-150 水平与血清CEA水平呈正相关（P﹤0.05）。ROC 曲线显示，miRNA-150 诊断NSCLC 的灵敏度、特异度分别为92.3%、90.9%。miRNA 即使在恶劣条件下，如煮沸、非常低或很高的pH 值和长时间储存时，仍保持高度稳定，可以作为稳定的检测指标。Salem 等[15]研究显示，miRNA-150-5p 诊断子宫内膜癌的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为88.9%、100%、100%、78.9%。本研究中，CEA 诊断NSCLC 的灵敏度和特异度分别为84.6%、71.7%，与miRNA-150 联合后灵敏度和特异度均提升，分别达到93.1%和100%。说明miRNA-150 与CEA 联合检测对NSCLC 的诊断效能较高。但鉴于本研究样本量有限，且样本来自同一医院，结果可能存在偏倚，未来需加大样本量进行多中心研究进一步验证。

综上所述，NSCLC 患者的血浆miRNA-150 水平较高，其与患者的临床特征无关，但与血清CEA水平呈正相关，与CEA 联合检测可有效诊断NSCLC。