不同季节高节竹竹叶提取物的抑菌活性研究

景怀山 宋雅迪

摘要：以不同季节的高节竹的竹叶为材料，研究竹叶提取物中黄酮类化合物不同季节的含量和竹叶提取物抑菌能力之间的关系。结果表明，竹叶提取物抑菌圈直径在夏秋季最小，冬春季最大，在1月份达到最大值。竹叶次生代谢产物中，异荭草苷、对香豆酸、异牡荆苷、芦丁、苜蓿素7-O-葡萄糖苷含量与抑菌圈直径显著正相关。香豆酸、异牡荆苷、芦丁是抑制大肠杆菌的主要活性成分，异牡荆苷是抑制金黄色葡萄球菌的主要活性成分。

关键词：季节；竹叶提取物；次生代谢产物；抑菌活性

在畜禽养殖规模化发展过程中，由细菌性疾病引起的畜禽高发病率和死亡率成为制约养殖业发展的重要因素。禽类感染大肠杆菌后会导致局部或全身性的感染，引发心包炎、急性败血症等疾病[1]。牛感染大肠杆菌、葡萄球菌后会引发乳房炎、传染性腹泻病等[2-3]，导致产奶量和乳制品质量下降。大肠杆菌亦可引起特定经济动物狐、貉、貂急性肺炎，引起水禽发生胃肠道和尿道感染[4-5]。金黄色葡萄球菌是最常见的脓胸感染微生物，感染动物后，也会引起猪渗出性皮炎[6]、小熊猫大叶性肺炎[7]。

为治疗畜禽细菌感染疾病，多年来一直大量使用抗生素，导致一些病原菌产生耐药性，增加防治难度的同时，药物残留的存在也会引起食品安全问题。植物提取物可以抑制病原菌，也可以通过提高机体的免疫功能，起到抗菌和抗病毒的目的，对其抑菌活性的研究也日益增多。在竹叶提取物抑菌作用方面，杨舒琪等[8]发现竹叶里的黄酮类化合物具有抗衰老、增强免疫力、抗菌和抑菌的能力。赵艳芹等[9]在对淡竹叶研究中发现纤维素对金黄色葡萄球菌有抑制能力，抑菌率达到94.8％。操海群等[10]对毛竹进行了抑菌性测试，并在毛竹粗提物中分离得到了组分中存在的乙酸乙酯具有较强的抑菌作用，得出毛竹的有效抑菌成分是苯酚类化合物和黄酮类化合物。

本研究通过对杭州地区高节竹不同季节下的抑菌效果进行分析，确定高节竹竹叶提取物抑菌效果明显的季节，并结合高节竹次生代谢产生的黄酮类化合物含量在不同月份的变化，找出影响高节竹竹叶提取物抑菌效果的主要影响因素，为高节竹作为天然植物抑菌提取物并利用、开发提供理论基础。

一、材料与方法

（一） 试验材料

本试验所用的高节竹竹叶提取物由新乡学院提供，竹叶的采集、提取物的制备方法及次生代谢产物的含量见徐小博等[11]论文。试验菌种为金黄色葡萄球菌和大肠杆菌。

（二） 研究方法

1、菌种的复苏、培养与制备。在无菌条件下，用1000μL移液枪吸取150μL菌液置于5 mL 培养液中，放入37℃恒温摇床中振荡培养24h。用接种环取第一代菌悬液，接种在琼脂平板上，置于37℃恒温培养箱中培养24h，再选取第二代细菌菌落中最典型的菌落，继续置于37℃恒温培养24h，得到可以提供试验的第三代菌种，在无菌条件下制作成菌悬液后放入冰箱冷冻保存、备用。使用时，将菌液自然解冻达到室温后，在无菌条件下，充分摇晃后，取150μL 菌悬液置于5 mL 培养液中，放入37℃恒温摇床中振荡培养24h 后使用。

2、培养基制备。营养肉汤培养基（液体）的制备：准确称取10 g蛋白胨、5 g牛肉膏、5 g氯化钠，加1000 mL蒸馏水进行溶解，将溶液 pH 调至7.20～7.40，后用高压蒸汽灭菌锅以121℃高温高压灭菌15min后备用。

营养肉汤琼脂培养基（固体）的制备：准确称取10 g蛋白胨、5 g牛肉膏、5 g氯化钠、15 g琼脂粉，加1000 mL蒸馏水进行溶解，将溶液 pH 调至7.20～7.40，后用高压蒸汽灭菌锅以121℃高温高压灭菌15min，等溶液冷却至合适温度后，在超净工作台的无菌环境下进行琼脂平板制作，等待平板冷却至室温后倒置备用。

3、抑菌试验方法。本试验使用琼脂平板打孔法，吸取菌悬液200μL，滴入制作好的营养肉汤琼脂平板上，用三角涂布棒均匀涂布待用。用打孔器在营养肉汤琼脂平板上均匀打4个孔， 向孔内分别滴入不同月份的高节竹提取物溶液200μL，向空白对照孔中滴入不加植物提取物溶液。将琼脂平板倒置放入37℃恒温培养箱中培养24h。观察每个孔洞周围是否有抑菌圈形成，并用卡尺测量其直径。

（三）数据分析

数据整理使用 Microsoft Excel 2013進行，并制作图表。方差分析、相关性分析、回归分析均使用 R软件完成。

二、结果与分析

（一） 竹叶提取物抑菌作用

由图1可知，高节竹的竹叶提取物对大肠杆菌有一定的抑制效果，且不同月份的竹叶提取物对大肠杆菌的抑菌活性不同。抑菌圈直径最大值出现在1月份，直径为2.00±0.10 cm，显著高于其他月份；直径最小值出现在7月份，直径为0.90±0.10 cm，显著低于1月份和3月份，但与5月份、9月份、11月份差异不显著。总体来看，抑菌圈直径变化趋势为先下降，然后升高，在11月份抑菌圈直径上升到1.20±0.00 cm。

由图2可知，高节竹的竹叶提取物对金黄色葡萄球菌也有一定的抑制效果，同样在不同月份之间有显著差异。抑菌圈直径最大值出现在1月份，直径为2.00±0.20 cm，显著高于其他月份；直径最小值出现在9月份，直径为0.90±0.20cm，显著小于1月份和3月份；3月份、5月份、7月份、11月份的抑菌圈直径差异不显著。总体来看，抑菌圈直径变化趋势为先下降，然后升高，在 11月份抑菌圈直径上升到1.20±0.10 cm。

（二）竹叶次生代谢产物对大肠杆菌抑菌活性的影响

由表1可知，竹叶次生代谢产物中异荭草苷、荭草苷、对香豆酸、牡荆苷、异牡荆苷、芦丁、苜蓿素7－ O－葡萄糖苷含量均与大肠杆菌抑菌圈直径正相关，其中异荭草苷、对香豆酸、异牡荆苷、芦丁、苜蓿素7－ O－葡萄糖苷含量与大肠杆菌抑菌圈直径相关性显著（p＜0.05）。木犀草苷和芹菜素与大肠杆菌抑菌圈直径负相关，但相关性均不显著。

为了进一步分析竹叶次生代谢产物与大肠杆菌抑菌圈直径之间的关系，建立大肠杆菌抑菌圈直径与异荭草苷、对香豆酸、异牡荆苷、芦丁、苜蓿素7－ O－葡萄糖苷含量的回归方程，根据 AIC准则使用逐步回归的方法对解释变量进行筛选，得到的最优回归方程保留了对香豆酸、异牡荆苷、芦丁三个解释变量（表2，F （3，14） ＝14.57，p＜0.001），对大肠杆菌抑菌圈直径的方差解释量 R2＝0.7055（p＜0.0001），说明对香豆酸、异牡荆苷、芦丁含量是大肠杆菌抑菌圈直径的主要影响因素。

（三）竹叶次生代谢产物对金黄色葡萄球菌抑菌活性的影响

由表3可知，竹叶次生代谢产物中异荭草苷、荭草苷、对香豆酸、牡荆苷、异牡荆苷、芦丁、苜蓿素7－ O－葡萄糖苷、芹菜素含量均与金黄色葡萄球抑菌圈直径正相关，其中异荭草苷、对香豆酸、异牡荆苷、芦丁、苜蓿素7－ O－葡萄糖苷含量与金黄色葡萄球抑菌圈直径相关性显著（p＜0.05）。木犀草苷与金黄色葡萄球抑菌圈直径负相关，但相关性不显著。

为了进一步分析竹叶次生代谢产物与金黄色葡萄球菌抑菌圈直径之间的关系，建立金黄色葡萄球菌抑菌圈直径与异荭草苷、对香豆酸、异牡荆苷、芦丁、苜蓿素7－ O－葡萄糖苷含量的回归方程，根据 AIC准则使用逐步回归的方法对解释变量进行筛选，得到的最优回归方程保留了异牡荆苷一个解释变量（表4，F （1，16） ＝21.28，p＜0.001），对金黄色葡萄球菌抑菌圈直径的方差解释量 R2＝0.5440（p＜0.0001），说明异牡荆苷是金黄色葡萄球菌抑菌圈直径的主要影响因素。

三、结论与讨论

（一） 讨论

本研究表明，高节竹的竹叶提取物抑菌效果随着季节的变化而改变。不同月份采集的竹叶，其提取物对大肠杆菌的抑菌效果不同，其中7月份抑菌强度最小，1月份抑菌强度最大。竹叶提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌效果也随着月份的变化而发生改变，9月份抑菌强度最小，1 月份最大。本研究证明了竹叶提取物抑菌作用的强弱与取样材料月份有相关性，抑菌效果顺序为冬季＞春季＞夏季＞秋季，与金兰梅等[12]试验结果相近，不同的地方可能是选用的竹子种类不同，亦或是竹子的产地不同导致的，其中不同地区的温度、湿度、紫外光等外界环境因素也是本次试验出现结果不同的可能原因。

本研究中高节竹体内的次生代谢产物主要是黄酮类化合物，竹叶提取物抑菌活性随季节的变化与黄酮类化合物随着季节变化有关。竹叶提取物中黄酮类化合物的总值在1月份到达最大值时，其抑菌作用最强；而7月份黄酮类化合物总值达到最小值时，其抑菌作用最小，与苏春花等[13]研究的结果相近，但与李元会等[14]研究结果不一致，原因可能是不同竹类对环境因素的反应不同。胡秀梅等[15]发现柿子叶中黄酮类化合物含量从5月份开始升高，到9月份达到最大值，然后又开始降低，10月份霜降后急剧降低。本研究中竹叶内黄酮类化合物总量随着季节变化会先降低后升高，而其抑菌作用的强弱也表现为先减弱后加强。主要原因是由于春季到夏季，竹子的枝和叶生长活动旺盛，竹叶光合作用加强，竹子体内主要进行初生代谢，消耗大量有机物，竹子体内次生代谢减弱，次生代谢产物减少；进入秋冬季节，气温和相对湿度降低，不利于竹子生长，并且竹子呼吸减慢，生长抑制剂含量上升，就加强了次生代谢，次生代谢产物合成加速并不断累积。

相关性分析和回归分析表明，大肠杆菌抑菌圈直径的最优回归模型保留了香豆酸、异牡荆苷、芦丁含量3个解释变量，对大肠杆菌抑菌圈直径的方差解释量 R2＝0.7055；金黄色葡萄球菌抑菌圈直径的最优回归模型保留了异牡荆苷含量1个解释变量，对金黄色葡萄球菌抑菌圈直径的方差解释量 R2＝0.5440。其中香豆酸、异牡荆苷、芦丁含量在夏秋季较小，冬春季较大，与竹叶提取物抑菌圈直径变化趋势一致，说明香豆酸、异牡荆苷、芦丁是抑制大肠杆菌的主要活性成分，異牡荆苷是抑制金黄色葡萄球菌的主要活性成分。

（二） 结论

高节竹的竹叶提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有一定的抑制作用，并具有显著差异，竹叶提取物抑菌圈直径在夏秋季最小，冬春季最大，变化趋势为先下降后上升，并在1月份达到最大值。竹叶次生代谢产物中，异荭草苷、对香豆酸、异牡荆苷、芦丁、苜蓿素7－ O－葡萄糖苷含量与抑菌圈直径显著正相关。香豆酸、异牡荆苷、芦丁是抑制大肠杆菌的主要活性成分，异牡荆苷是抑制金黄色葡萄球菌的主要活性成分。

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作者简介：景怀山（1966-），男，河南登封人，畜牧师，研究方向：畜禽疫病防治。

（责任编辑曹雯梅）