反相高效液相色谱法测定头孢地尼及制剂中的聚合物类杂质

2023-05-30杨倩张琳曹晓云唐素芳

中国抗生素杂志 2023年2期

杨倩张琳曹晓云唐素芳

摘要：目的建立反相高效液相色谱法测定头孢地尼及制剂中的聚合物杂质。方法以CAPCELL PAK C18 MGⅡ为色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），0.25%四甲基氢氧化铵溶液（pH 5.5）[每1000mL中加入0.1 mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液0.4 mL]-甲醇-乙腈为流动相系统，梯度洗脱，建立了头孢地尼聚合物类杂质的分析方法并进行了方法学验证。采用二维液质联用法对检出的聚合物类杂质进行定性分析。结果在该色谱条件下头孢地尼及已知杂质均与头孢地尼聚合物间分离良好，头孢地尼检测浓度的线性范围为0.30～30.1 μg/mL（r=1.0000），方法的检测限与定量限分别为1.5 ng和4.5 ng。所建立的方法能够检出头孢地尼二聚体，头孢地尼二聚体的多个同分异构体及头孢地尼三聚体。结论本方法专属性好，灵敏度高，耐用性好，可用于头孢地尼及其制剂中聚合物杂质的控制。

关键词：头孢地尼；聚合物；杂质；反相高效液相色谱法；二维液质联用

中图分类号：R978.1 文献标志码：A

Determination of polymer impurities in cefdinir and preparations by RP-HPLC

Yang Qian， Zhang Lin， Cao Xiao-yun， and Tang Su-fang

（Tianjin Institute for Drug Control， Tianjin 300070）

Abstract Objective To establish a reverse high-performance liquid chromatography （HPLC） for the separation and determination of polymers in cefdinir and its preparations. Methods The method was performed by using CAPCELL PAK C18 MG Ⅱ column （250 mm×4.6 mm，5 μm）. The mobile phase was 0.25% tetramethyl ammonium hydroxide （pH5.5） containing 0.1 mol/L disodium EDTA solution （0.4 mL per 1000 mL）-acetonitrile-methanol. The gradient elution was used. The method was validated， and the polymer impurities were analyzed by the two dimensional liquid chromatography-mass spectrometry method. Results Cefdinir， the identified impurities and polymers were separated effectively. The linear range of cefdinir was 0.30～30.1 μg/mL （r=1.0000）. The limit of detection was 1.5 ng and the limit of quantitation was 4.5 ng. Cefdinir dimer， isomers of cefdinir dimer， and cefdinir trimer can be detected by the new method. Conclusion The established RP-HPLC method with good robustness is specific and sensitive. Therefore， it can be used for the control of polymer impurities in the pharmaceutical preparations.

Key words Cefdinir; Polymers; Impurities; RP-HPLC; 2D-LC-MS

頭孢地尼为半合成第三代β-内酰胺类抗生素，由日本藤泽药品工业公司研发，1991年首次在日本上市，2001年国产仿制药获准上市。头孢地尼通过抑制细菌细胞壁的合成产生抗菌作用，对革兰阳性菌和阴性菌均有抗菌活性，在临床上广泛应用于内外科、皮肤科和妇产科等敏感菌导致的感染。不良反应轻微，以消化道反应和过敏反应最为常见。而过敏反应正是β-内酰胺类抗生素最受关注的一类不良反应，引发过敏反应的过敏原是β-内酰胺类抗生素中的聚合物杂质[1-3]。该类杂质在药品的生产、贮藏、运输过程中均有可能产生，因此《中国药典》从2000年版开始对其进行控制。

头孢地尼分子结构7位侧链存在氨基活性基团，理论上可以发生L型和N型聚合反应生成聚合物类杂质。《中国药典》2020年版、USP2021、《日本药局方》XVⅡ均收载了头孢地尼，但标准中均未设定聚合物类杂质检查项。有文献报道采用葡聚糖凝胶G10法和高效凝胶色谱法测定头孢地尼中的高分子杂质[4-5]，这也是目前对β-内酰胺类抗生素中聚合物类杂质进行控制的主要方法。但上述方法对聚合物的分离分析能力有限，专属性差，一般无法满足准确控制该类杂质的要求。研究表明，通过色谱条件的优化，很多β-内酰胺类抗生素中的聚合物类杂质可以在反相高效液相色谱系统中被测定[6-8]。本研究参考文献[9]建立了头孢地尼原料和制剂中聚合物杂质的分析方法并利用二维液质联用技术对检出的聚合物类杂质进行了定性研究。

1 仪器与试药

LC-20AD高效液相色谱仪（日本岛津公司），1260高效液相色谱仪（美国Agilent公司），Waters ACQUITY UPLCTM2D色谱仪及Xevo G2-S QTof质谱系统（美国Waters公司），Mettler Toledo XS 205型电子分析天平（瑞士Mettler公司）。

头孢地尼（3家生产企业，7批样品），头孢地尼胶囊（6家生产企业，17批样品），头孢地尼分散片（7家生产企业，21批样品），头孢地尼片（1家生产企业，3批样品），头孢地尼对照品（批号130502-201904，纯度98.1%）购自中国食品药品检定研究院，头孢地尼已知杂质对照品A～U由厂家提供；甲酸（LCMS级）购自美国Sigma公司；乙腈、甲醇（色谱纯）购自美国Merck公司；其他试剂（分析纯）均购自国药集团化学试剂公司；水为屈臣氏纯净水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

2.1.1 反相液相色谱条件（一维色谱）

色谱柱：CAPCELL PAK C18 MGⅡ（250 mm×4.6 mm，5 μm）。流动相A：0.25%四甲基氢氧化铵溶液（用磷酸调节pH值至5.5），每1000 mL中加入0.1 mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液0.4 mL；流動相B：0.25%四甲基氢氧化铵溶液（用磷酸调节pH值至5.5）-乙腈-甲醇（500：300：200），每1000 mL中加入0.1 mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液0.4 mL，线性梯度洗脱。洗脱梯度：0～10 min（20%～50% B）→10～1 5 min（50%～75% B）→15～20 min（75% B）→20～21 min（75%～20% B）→21～30 min（20% B）。流速：1.1 mL/min；柱温：40℃；检测波长：254 nm；进样量：20 μL。

2.1.2 二维液相色谱条件

色谱柱：Waters HSS T3 C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）。流动相A ：0.1%甲酸溶液；流动相B：乙腈；在线除盐后，线性梯度洗脱：0～5 min（2%～95% B）。柱温：35℃；流速：0.4 mL/min。

2.1.3 质谱条件

离子源为ESI源，正离子模式，扫描范围：m/z 50～1500；离子源温度：110℃；毛细管电压 3.0 kV；雾化器温度：450℃；雾化器流速800 L/h。

2.2 溶液的配制

溶剂：0.l mol/L磷酸盐缓冲液[0.l mol/L磷酸氢二钠溶液-0.l mol/L磷酸二氢钾溶液（2：1）]。

系统适用性溶液：取头孢地尼原料（批号Ap006-2011-009）约500 mg，加入三氯甲烷8 mL，三乙胺2 mL，振摇5 min，密封，室温避光放置48 h。旋转蒸发去除三氯甲烷和三乙胺，制成固体粉末作为碱破坏样品[9]。称取上述碱破坏样品约15 mg，置于10 mL量瓶中，加溶剂2 mL溶解，再用流动相A（一维）稀释至刻度，摇匀，即得。

供试品溶液：取头孢地尼约37.5 mg（制剂：取重量差异项下细粉或装量差异项下内容物适量，约相当于头孢地尼37.5 mg），精密称定，置25 mL量瓶中，加溶剂4 mL溶解后，用流动相A（一维）稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。制剂过滤后，取续滤液作为供试品溶液。

对照品溶液：取头孢地尼对照品约37.5 mg，精密称定，置25 mL量瓶中，加溶剂4 mL溶解后，用流动相A（一维）稀释至刻度，摇匀。精密量取该溶液1 mL置100 mL量瓶中，用流动相A（一维）稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性试验试验

考察了系统适用性试验溶液、头孢地尼已知杂质对照品混合溶液及头孢地尼原料（批号Ap006-2011-009）在酸、碱、氧化、高温和光照条件下产生杂质的分离情况。结果表明，在新建立的色谱系统中，已知杂质、破坏所产生的降解杂质均能与头孢地尼实现良好分离。除系统适用性试验溶液中的相对保留时间为2.1特定杂质外，已知杂质和主要降解杂质的相对保留时间均小于2.0，该方法专属性良好，见图1～3。

2.3.2 线性范围

取头孢地尼对照品按逐步稀释法制成不同浓度的对照品溶液进行试验，结果表明头孢地尼在0.30～30.1 μg/mL范围内，浓度与峰面积呈线性相关y=37014x-612.84（r=1.0000）。对照品溶液浓度在供试品溶液浓度的0.02%到2%范围内线性良好。

2.3.3 检测限和定量限

以头孢地尼对照品溶液（约15 μg/mL）标化碱破坏样品中头孢地尼二聚体的含量，头孢地尼二聚体的检测限（按S/N=3计）为1.5 ng，相当于0.005%；定量限（按S/N=10计）为4.5 ng，相当于0.015%。

2.3.4 溶液稳定性试验

取供试品溶液（头孢地尼分散片，批号10201103）分别于4℃放置0、1、2、4、8和12 h后进样分析，该供试品溶液中检出杂质个数相同，聚合物类杂质均小于定量限，聚合物类杂质低温放置12 h未见明显增多。

2.3.5 耐用性试验

试验考察了不同仪器、不同色谱柱在不同流速下对聚合物类杂质的检出能力，结果表明色谱条件的变化对测定结果影响不大，见表1。

2.4 聚合物类杂质定性分析

取系统适用性溶液注入二维液质联用仪，记录色谱图，对图3中检出的杂质1～9进行定性研究，结果见表2，聚合物特征质谱图见图4～5。研究表明，碱破坏样品中含有多个头孢地尼二聚体和头孢地尼三聚体，互为同分异构体，存在优势聚合，以杂质2（相对保留时间为2.12）的二聚体杂质为主。专属性试验显示出峰时间最晚的杂质U的相对保留时间为2.0（图2），而头孢地尼聚合物类杂质的相对保留时间均大于2.0，考虑到该保留时间范围内检出的杂质除聚合物杂质外还存在少量的小分子杂质，故将相对保留时间大于2.0的杂质作为有关物质Ⅱ，对其总量进行控制。

2.5 样品测定结果

取头孢地尼原料、头孢地尼胶囊、头孢地尼分散片及头孢地尼片，照“2.1”项下色谱条件测定，特征色谱图见图6，结果见表3。

3 讨论

3.1 系统适用性溶液的选择

头孢地尼分子结构7位侧链存在氨基活性基团，在碱性条件下，氨基活性基团更易进攻β-内酰胺环发生L型反应；酸性条件下，更易发生N型聚合反应。试验对酸加热破坏破坏样品和碱破坏样品进行了测定，结果表明碱破坏样品中存在多个头孢地尼的二聚体杂质和少量的三聚体杂质，其中以相对保留时间约为“2.1”的头孢地尼二聚体最多。酸加热破坏样品中产生的相对保留时间大于“2.1”的杂质中经质谱鉴定均不是聚合物类杂质。

3.2 梯度洗脱条件的选择

《中国药典》2020年版收载的头孢地尼有关物质检查项色谱条件由于有机相比例较低且变化缓慢（42 min有机相比例变化为2.5%～25%），无法在一个梯度程序内将极性较小杂质洗脱出色谱柱。试验尝试了3种梯度程序，15 min内有机相的比例变化分别为10%～37.5%、10%～45%、10%～50%。结果表明3个条件均可将系统适用性溶液中破坏生成的极性较小杂质有效洗脱，对样品中极性较小杂质的检出结果相同。故最终选择有机相比例变化范围在10%～37.5%的梯度洗脱程序。

3.3 检测波长的选择

头孢地尼和碱破坏生成的头孢地尼二聚体的紫外特征图谱在建立的色谱系统中相似，均在225 nm和280 nm附近存在最大吸收，而《中国药典》2020年版收载的头孢地尼有关物质检查方法检测波长为254 nm。试验采用头孢地尼碱破坏样品（约含头孢地尼二聚体15 μg/mL）考察了头孢地尼二聚体在这3个波长处的信噪比。结果显示虽然该杂质在225 nm波长处的响应值最高，但基线波动也随之加大，综合比较最终选择254 nm为测定波长。

3.4 聚合物杂质及未知杂质结构分析

由表2可知相对保留时间大于2.0的杂质包括多个互为同分异构体的头孢地尼二聚体和头孢地尼三聚体，这些同分异构体的结合位点和取代位点各异，质谱碎片信息相似，仅凭质谱信息很难确证其结构，但可以确定其为聚合物类杂质。另试验还对[M+H]+为442的杂质推断了可能的结构。杂质的可能结构见图7。

4 结论

本实验所建立的方法能够在较短分析时间内完成对头孢地尼及制剂中存在的微量聚合物杂质的测定。对不同来源的原料和3种口服制剂共48批样品检测，结果表明，仅1个厂家生产的头孢地尼分散片（批号：20033002）有关物质Ⅱ总量超过0.1%，这说明头孢地尼原料和制剂在生产和贮藏过程中不易聚合生成聚合物類杂质。

参考文献

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