发酵改性黑米渣膳食纤维工艺及功能特性研究

关玉婷 张瑞 柴燃 田振扬 常世敏

摘要：為提升黑米渣的利用率，该研究以黑米渣为原料，探究发酵改性黑米渣膳食纤维（fermented modified black rice residue dietary fiber，FBD）的最优工艺，并对其持水力、持油力和体外吸附能力进行研究；采用粗糙脉孢菌对黑米渣发酵改性，以纤维素酶活力为评价指标，通过单因素试验和响应面试验对发酵改性工艺参数进行优化；通过测定发酵前后黑米渣膳食纤维的组成成分、吸附能力和微观结构，研究发酵改性对FBD功能特性的影响。在发酵时间6 d、料液比1∶0.6 （g/mL）、发酵温度29 ℃的条件下效果最优，纤维素酶活力为2.399 U；相比未发酵改性黑米渣膳食纤维（unfermented modified black rice residue dietary fiber，UFBD），FBD的可溶性膳食纤维含量提升了71.68%，纤维素含量降低了22.83%。膨胀力、持水力和持油力分别增加了1.9，2.3，2.6倍。胆固醇吸附能力、葡萄糖吸附能力和胆酸钠吸附能力均极显著提升。扫描电镜、红外光谱和X射线衍射分析表明，FBD具有疏松多孔的结构，结晶度降低。该研究确定了发酵改性黑米渣膳食纤维的最优工艺，得出了发酵改性对黑米渣膳食纤维功能特性的影响，为黑米渣的综合开发利用奠定了理论基础。

关键词：黑米渣；膳食纤维；发酵；改性；响应面法；功能特性

中图分类号：TS201.1      文献标志码：A     文章编号：1000-9973（2023）05-0010-07

Abstract： In order to improve the utilization rate of black rice residues， in the study， with black rice residues as the raw materials， the optimal process of fermented modified black rice residue dietary fiber （FBD） is explored， and its water holding capacity， oil holding capacity and in vitro adsorption capacity are studied. Black rice residues are fermented and modified by Neurospora crassa. With cellulase activity as the evaluation index， the fermentation and modification process parameters are optimized by single factor test and response surface test. The effects of fermentation and modification on the functional characteristics of FBD are studied by determining the components， adsorption capacity and microstructure of dietary fiber from black rice residues before and after fermentation. Under the conditions of fermentation time of 6 d， solid-liquid ratio of 1∶0.6 （g/mL） and fermentation temperature of 29 ℃， the effect is the best and the cellulase activity is 2.399 U. Compared with unfermented modified black rice residue dietary fiber （UFBD）， the soluble dietary fiber content of FBD increases by 71.68%， and the cellulose content decreases by 22.83%. The expansion capacity， water holding capacity and oil holding capacity increase by 1.9， 2.3， 2.6 times respectively. The adsorption capacity of cholesterol， glucose and sodium cholate is significantly improved. Scanning electron microscopy， FT-IR spectra and X-ray diffraction analysis show that FBD has a loose porous structure and the crystallinity  decreases. In this  study， the optimal fermentation and modification process of black rice residue dietary fiber is determined， and the effects of fermentation and modification on the functional characteristics of black rice residue dietary fiber are found out， which has laid a theoretical foundation for the comprehensive development and utilization of black rice residues.

Key words： black rice residue; dietary fiber; fermentation; modification; response surface methodology; functional characteristics

黑米中含有丰富的花色苷，食品工业中提取花青素后的黑米渣通常被作为废料处理，而黑米渣中仍含有膳食纤维、蛋白质和脂肪等物质，其中膳食纤维含量可达22.40%[1]，大部分为不溶性膳食纤维，不易与其他营养物质结合，口感较差，使其在食品工业中的应用受到极大限制。因此，可通过对黑米渣膳食纤维改性，改善其功能特性，提升黑米渣的利用价值。

发酵法改性膳食纤维是通过微生物发酵产生大量生物活性物质，如有机酸、纤维素酶等，使不溶性膳食纤维转化为可溶性膳食纤维，改善其结构、功能特性。朱妞[2]利用绿色木霉发酵改性苹果渣膳食纤维，有效地提升了可溶性膳食纤维的含量，并改善了膳食纤维的理化性质，提升了苹果的附加值。徐灵芝等[3]比较了发酵及化学法改性雷竹笋渣的理化性质，发现发酵法改性后，持水力及吸附能力均优于化学法。张艳莉等[4]发现发酵改性后豆渣膳食纤维的持水力、持油力均得到明显改善，且抗氧化能力显著提升。

粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）可在纤维素含量高的培养基中生长旺盛，产生较高活性的纤维素酶系[5]。目前关于粗糙脉孢菌产纤维素酶系的研究多集中在产酶条件的探究方面，而少见将其应用于膳食纤维改性方面的研究。同时，有关黑米渣膳食纤维改性及其化学成分、结构、功能性的研究目前未见文献报道。因此，本研究采用粗糙脉孢菌发酵改性黑米渣膳食纤维，以纤维素酶活力为指标，探究最优发酵改性工艺，对发酵改性黑米渣膳食纤维的成分、物理性质及功能特性进行研究，为提升黑米渣的利用率奠定了理论基础。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

黑米渣：来源于提取花色苷后的黑米渣；粗糙脉孢菌：上海保藏生物技术中心；葡萄糖、酒石酸钾钠、苯酚、无水亚硫酸钠、一水柠檬酸、硫酸铵、磷酸二氢钾：均为分析纯，天津欧博凯化工有限公司；胆固醇标准品（纯度99.5%）、胆酸钠标准品（纯度98%）：上海麦克林生化科技有限公司；热稳定α-淀粉酶（10 000 U）、碱性蛋白酶（400 U）、淀粉葡萄糖苷酶（2 000 U）：上海瑞楚生物科技有限公司。

Hitachi SU-8220扫描电子显微镜 日本株式会社日立制作所；D/Max-2200 X-射线粉末衍射仪 日本理学株式会社；Avatar 370傅里叶变换红外光谱仪 美国Nicolet公司；UV-6000紫外分光光度计 上海元析仪器有限公司；MJ-1608BSH-Ⅱ霉菌培养箱 上海新苗医疗器械制造有限公司；SW-CJ-2F双人双面净化工作台 苏州净化设备有限公司；电子分析天平 奥豪斯仪器（常州）有限公司；多功能粉碎机 永康市珀欧五金制品有限公司。

1.2 方法

1.2.1 发酵改性黑米渣膳食纤维制备工艺

将研磨后的黑米渣过40目筛，精确称取30.00 g加入锥形瓶中，按料液比1∶0.5 （g/mL）加入蒸馏水，摇匀，121 ℃灭菌20 min，得到黑米渣固态培养基。

将长有孢子的粗糙脉孢菌斜面置于超净工作台中，倒入10 mL 无菌水，振荡，使无菌水将孢子洗脱，使用4层无菌纱布过滤除去菌丝，获得孢子悬液。取 1 mL 孢子懸液梯度稀释后测得吸光值，使最终接种浓度为 OD600=0.08，将其接入黑米渣固态培养基中，27 ℃培养4 d。

发酵完成后，置于105 ℃鼓风干燥箱中过夜，粉碎，称重。每克样品加入25 mL石油醚进行脱脂，重复3次，105 ℃干燥过夜；依次经热稳定α-淀粉酶、碱性蛋白酶和淀粉葡萄糖苷酶处理后，用4倍体积的95%乙醇沉淀过夜，5 000 r/min离心10 min，收集下层固体，冷冻干燥得到FBD。

1.2.2 单因素试验

精确称取30.00 g黑米粉加入锥形瓶中，按料液比1∶0.6 （g/mL）制备黑米渣固态培养基，摇匀，121 ℃灭菌20 min，接种1 mL浓度为OD600=0.08的粗糙脉孢菌孢子悬液，于27 ℃分别培养4，5，6，7，8 d，以纤维素酶活力为指标，探究发酵时间对产酶量的影响。

精确称取30.00 g黑米粉加入锥形瓶中，制备不同料液比1∶0.4、1∶0.6、1∶0.8、1∶1、1∶1.2 （g/mL）的黑米渣固态培养基，摇匀，121 ℃灭菌20 min，接种1 mL浓度为OD600=0.08的粗糙脉孢菌孢子悬液，于27 ℃培养5 d，以纤维素酶活力为指标，探究不同料液比对产酶量的影响。

精确称取30.00 g黑米粉加入锥形瓶中，按料液比1∶0.6 （g/mL）制备黑米渣固态培养基，摇匀，121 ℃灭菌20 min，接种1 mL浓度为OD600=0.08的粗糙脉孢菌孢子悬液，在不同温度（26，27，28，29，30 ℃）下培养5 d，以纤维素酶活力为指标，探究不同发酵温度对产酶量的影响。

1.2.3 响应面优化试验

1.2.4 纤维素酶活力测定

称取1 g固体发酵物，加入0.1 mol/L柠檬酸-柠檬酸钠（pH 5.2）缓冲液10 mL，180 r/min振荡30 min。4 ℃离心10 min，取上清液即为粗酶提取液。纤维素酶活力测定参考Ghose[6]的方法。

酶活力单位的定义：在45 ℃条件下，每分钟催化底物水解释放 1 μmol葡萄糖所需要的酶量，即为1个酶活力单位（U）。

1.2.5 理化特性分析

1.2.5.1 组成成分测定

蛋白质、脂肪、淀粉、灰分、总膳食纤维、可溶性膳食纤维、不溶性膳食纤维含量测定参考GB 5009.88－2014《食品安全国家标准 食品中膳食纤维的测定》，纤维素、半纤维素和木质素含量测定参考Lin等[7]的方法。

1.2.5.2 持水力测定

参考Jia等[8]的方法，在烧杯中加入1.00 g干燥的FBD和50 mL蒸馏水，25 ℃水浴1 h后，3 500 r/min离心15 min，取下层沉淀称重。

持水力（g/g）=样品干重（g）-样品湿重（g）样品干重（g）。

1.2.5.3 持油力测定

将1.00 g干燥的FBD置于10 mL植物油中，充分混匀后于37 ℃水浴1 h，3 000 r/min离心20 min。离心后，除去样品上层油和剩余油[8]。

持油力（g/g）=样品干重（g）-样品湿重（g）样品干重（g）。

1.2.5.4 膨胀力测定

向100 mL量筒中加入1.00 g干燥的FBD和50 mL蒸馏水，摇匀，置于室温下静置24 h。

膨胀力（mL/g）=溶胀后体积（mL）-初始体积（mL）样品干重（g）。

1.2.5.5 对葡萄糖吸附能力测定

将1.00 g干燥的FBD和20 mL 50 mmol/L的葡萄糖溶液置于50 mL离心管中，37 ℃水浴2 h后，4 000 r/min离心20 min，采用DNS法（540 nm）测定上清液葡萄糖含量。

对葡萄糖的吸附能力（mmol/g）=

初始葡萄糖含量（mmol） -上清液中葡萄糖含量（mmol）样品干重（g）。

1.2.5.6 对胆固醇吸附能力测定

将新鲜的蛋黄用9倍质量的蒸馏水制成乳液。取2.00 g干燥的FBD和50.00 g蛋黄乳液加入锥形瓶中混匀，分别将pH值调节至2.0（模拟胃内环境）和7.0（模拟小肠环境），置于37 ℃摇床中180 r/min振摇2 h后，4 000 r/min离心20 min，收集上清液，采用邻苯二甲醛比色法（560 nm）测定上清液中胆固醇含量。

对胆固醇的吸附能力（mg/g）=

蛋黄中胆固醇含量（mg）-上清液中胆固醇含量（mg）样品干重（g）。

1.2.5.7 对胆酸钠吸附能力测定

向锥形瓶中加入0.50 g干燥的FBD和100 mL含有0.20 g胆酸钠的0.15 mol/L NaCl溶液，混合均匀，置于37 ℃摇床中180 r/min振摇2 h后，4 000 r/min离心20 min，收集上清液，采用糠醛比色法（620 nm）测定胆酸钠含量。

对胆酸钠的吸附能力（mg/g）=初始胆酸钠含量（mg） -上清液中胆酸钠含量（mg）

样品干重（g）。

1.2.6 结构表征

1.2.6.1 扫描电镜分析

取10.00 mg干燥的FBD固定在样品台上，进行喷金处理，厚度为10～20 nm，工作电压逐渐从5 kV升至10 kV，观察不同倍数（×1 000，×2 000）下的样品形貌。

1.2.6.2 傅里叶红外光谱分析

取2.00 mg干燥的FBD和200.00 mg干溴化钾粉末研磨混合，挤压制成薄片，迅速放入仪器扫描，扫描范围500～4 000 cm-1。

1.2.6.3 X射线衍射分析

将干燥的膳食纤维粉末置于涂抹了凡士林的玻璃板上，放入X射线衍射仪中，设定参数为2°/min掃描50°～60°。

1.3 数据处理

试验数据表示为平均值±标准误，数据处理采用SPSS 20.0，绘图采用Origin 2021和GraphPad Prism 8。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

不同发酵时间对纤维素酶活力的影响见图1中A。随着发酵时间的增加，纤维素酶活力先增加后保持不变，在发酵6 d时，纤维素酶活力最大，达到1.91 U。随着发酵时间的增加，培养基中的营养成分被持续消耗，在第6天时纤维素酶活力达到最大值，继续增加发酵时间，培养基为粗糙脉孢菌提供的营养不足，菌种开始退化，造成纤维素酶活力不再增加。

不同料液比对纤维素酶活力的影响见图1中B。纤维素酶活力随着料液比的增加先升高后降低，当料液比为1∶0.6 （g/mL）时，纤维素酶活力达到最大，为1.9 U。过高的料液比使粗糙脉孢菌生长环境水分含量过高，不利于菌种生长及纤维素酶的产生。

不同发酵温度对纤维素酶活力的影响见图1中C。纤维素酶活力随着发酵温度的升高先升高后降低，在29 ℃时纤维素酶活力达到最大，为1.8 U。发酵温度超过菌体最适生长温度会加速菌体的退化，不利于纤维素酶产生，并且使已产生的纤维素酶活力降低。

2.2 响应面优化结果

在单因素试验的基础上，以纤维素酶活力为指标，采用Design-Expert 10软件建立Box-Behnken法进行试验设计，确定发酵改性黑米渣膳食纤维的最佳工艺，试验设计及结果见表2。

对表2中试验数据进行二次多项回归拟合，获得纤维素酶活力（Y）对发酵时间（A）、料液比（B）、发酵温度（C）的多元回归方程为Y=2.349+0.042A－0.112B+0.038C+6.99E－0.007AB+0.132AC－0.034BC－0.208A2－0.335B2－0.232C2。

该模型的方差分析结果见表3。

以纤维素酶活力为评价指标，对模型进行统计学检验并分析，由表3可知，该回归模型的P<0.01，极显著，失拟项的P=0.397>0.05，不显著，回归模型相关系数R2=0.969 7，RAdj2=0.930 7，拟合程度良好，可用于预测纤维素酶活力。单因素B极显著（P<0.01），3个因素的F值分别为2.726，19.045，2.236，因此，影响大小排序为B（料液比）>A（发酵时间）>C（发酵温度）。

由图2可知，等高线接近圆形，表明发酵时间与料液比的交互作用不明显，对纤维素酶活力的影响不显著。由图3可知，发酵时间与发酵温度的交互作用对纤维素酶活力具有显著影响，与表3回归模型方差分析结果一致。根据软件回归模型计算预测当发酵时间（A）为6.97 d、料液比（B）为1∶0.57 （g/mL）、发酵温度（C）为29.37 ℃时，纤维素酶活力为2.234 U。

2.3 发酵改性对黑米渣膳食纤维组成成分的影响

发酵改性对黑米渣膳食纤维组成成分的影响见表4。

由于FBD样品是真空冷冻干燥的，因此未进行水分含量的测定。由表4可知，发酵后可溶性膳食纤维含量从17.3%显著提升至29.7%，纤维素含量从9.2%降低到7.1%，半纤维素含量从45.6%降低到38.2%，木质素含量从7.3%降低到6.7%。这是由于粗糙脉孢菌产生了高活性纤维素酶系，黑米渣中的纤维素、半纤维素和木质素在发酵过程中被分解。

2.4 发酵改性对黑米渣膳食纤维水合特性的影响

发酵改性对黑米渣膳食纤维持水力、持油力及膨胀力的影响见图5。

发酵改性会使膳食纤维的物理特性改变，如粒度和比表面积等[9]。膳食纤维的粒径和比表面积与持水力、持油力及膨胀力密切相關[10]。膨胀力表示物质吸收和膨胀水分的能力[11]，由（2.33±0.01） mL/g上升至（4.33±0.12） mL/g。通过发酵改性，黑米渣膳食纤维的持水力极显著提高（P<0.01）。UFBD的持水力为2.91 g/g，极显著低于FBD（P<0.01），因为发酵改性破坏了半纤维素和纤维素之间的共价键，可溶性膳食纤维的含量增加[12]。持油力从1.30 g/g增加到3.42 g/g，FBD的持油力极显著高于UFBD（P<0.01），可能是由于发酵改性增加了膳食纤维的网络结构，从而提升了FBD的持油力。

2.5 发酵改性对黑米渣膳食纤维吸附能力的影响

在pH 2.0和pH 7.0时（模拟胃和肠的酸性环境），UFBD和FBD对胆固醇的吸附能力见图6。

由图6可知，FBD对胆固醇的吸附能力极显著高于UFBD。这是由于发酵改性后黑米渣膳食纤维表面疏松多孔，增强了对胆固醇的吸附能力。同时，FBD在小肠中的吸附能力优于在胃中，这是由于FBD和胆固醇都带有部分正电荷，相同的电荷在酸性条件下产生排斥力，导致其在胃中对胆固醇的吸附能力较差[13]。

膳食纤维对葡萄糖的吸附可以降低葡萄糖在体内的扩散速率，降低葡萄糖在体内的吸收，从而抑制餐后血糖的升高。由图7可知，发酵改性极显著地增强了FBD的葡萄糖吸附能力（P<0.01）。这可能是由于黑米渣膳食纤维的极性和非极性基团在发酵过程中暴露出来，增强了FBD与葡萄糖分子之间的结合[14]。结合扫描电镜结果，FBD的比表面积和多孔结构都得到了提升。

胆汁酸调节肠道中胆固醇的合成，并在脂肪代谢中起重要作用。膳食纤维与胆汁酸的结合抑制了部分胆固醇的合成，同时降低了体内胆汁酸和胆固醇的浓度[15]。人体胆汁的大部分物质为胆酸钠。研究比较FBD和UFBD与胆酸钠的结合能力以评估其体外降胆固醇能力。由图7可知，FBD对胆酸钠的吸附能力极显著高于UFBD（P<0.01），表明发酵增强了黑米渣膳食纤维对胆酸钠的体外吸附能力。

2.6 发酵改性对黑米渣膳食纤维微观结构的影响

由图8可知，UFBD的表面结构紧凑、致密、不规则，而FBD的表面结构疏松，孔隙较多。发酵改性破坏了黑米渣膳食纤维的微观结构，分解了部分纤维素、半纤维素和木质素，导致FBD形成多孔和疏松结构。FBD的结构有助于吸附能力的提升，因此FBD的理化性质和功能特性优于UFBD。

2.7 发酵改性对黑米渣膳食纤维红外光谱的影响

FT-IR可以显示黑米渣膳食纤维在发酵改性前后化学键和官能团的变化，大量研究表明，生物改性可导致膳食纤维结构和红外光谱的变化[16-17]。发酵改性前后黑米渣膳食纤维红外光谱图见图9。

由图9可知，FBD和UFBD表现出相似的光谱分布和不同强度的吸收峰。FBD和UFBD分别在3 418.3 cm-1和3 389.2 cm-1处有强吸收峰，这是由于纤维素和半纤维素分子的O-H拉伸，导致氢键断裂；在2 927.7 cm-1处的吸收峰是由多糖中的C－H拉伸振动引起的，为多糖的特征吸收峰[18]；在1 621.9 cm-1和1 654.8 cm-1处的吸收峰为CO的拉伸；在1 000～1 200 cm-1之间的吸收峰被认为是碳水化合物的特征区域，主要由木质素中C—O—C拉伸振动引起[19]。上述结果表明，发酵改性未改变黑米渣膳食纤维的基本结构，但分解了部分纤维素、半纤维素和木质素，与成分组成和扫描电镜结果一致。

2.8 发酵改性对黑米渣膳食纤维晶体结构的影响

由图10可知，发酵改性前后的衍射峰分别为20.87°和21.48°，表明晶体类型为纤维素Ⅰ，即结晶区和非结晶区共存[15]。FBD的衍射峰比UFBD的衍射峰更尖锐，但FBD的衍射峰低于UFBD的衍射峰，FBD结晶度降低，可能是由于发酵改性分解了纤维素、半纤维素等物质，降低了结晶度，即结晶区域减少和非结晶区域增加，与Li等[20]的研究结果一致。

3 结论

本研究采用粗糙脉孢菌对黑米渣膳食纤维进行发酵改性，探究了发酵改性的最佳工艺条件，并对改性前后的黑米渣膳食纤维结构及功能特性进行了比较。研究表明，当发酵时间为6 d，料液比为1∶0.6 （g/mL），发酵温度为29 ℃时，纤维素酶活力最高，为2.399 U。FBD基本化学结构未被破坏，持水力、持油力和膨胀力均显著提升，对胆固醇、葡萄糖和胆酸钠的吸附能力得到显著改善，结构疏松多孔，表面由平滑变为粗糙，为黑米渣的利用提供了理论支撑。但本研究的吸附作用均为体外进行，并未对FBD体内代谢机制进行研究，应作为后续研究重点，以满足相关产品的开发生产需求。

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