肉苁蓉中多糖物质成分分析及抗氧化活性研究

肖林霞 苏远

摘要：文章通過对肉苁蓉中多糖物质进行提取，采用DEAE纤维素柱层析法对肉苁蓉粗多糖CLP进行纯化，获取肉苁蓉中性糖CLP1和肉苁蓉酸性糖CLP2。采用紫外光谱扫描的方法测定肉苁蓉粗多糖CLP、肉苁蓉中性糖CLP1和肉苁蓉酸性糖CLP2中的总糖、糖醛酸以及蛋白质含量，并对多糖分子量和单糖组成成分进行测定，同时对肉苁蓉粗多糖CLP、肉苁蓉中性糖CLP1和肉苁蓉酸性糖CLP2的DPPH自由基清除能力和总抗氧化能力进行实验分析。测定数据表明，肉苁蓉粗多糖CLP、肉苁蓉中性糖CLP1和肉苁蓉酸性糖CLP2的组成成分接近，但含量存在较大的差异；肉苁蓉中性糖CLP1和肉苁蓉酸性糖CLP2在利用DEAE纤维素色谱柱进行分离纯化时能够获取到多个洗脱峰，分子量分布在0～10 000 Da之间，表明肉苁蓉多糖主要组成成分为小分子糖。肉苁蓉中性糖CLP1单糖测定结果表明，肉苁蓉中性糖CLP1中含有的单糖主要为甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖以及阿拉伯糖；肉苁蓉酸性糖CLP2单糖测定结果表明，肉苁蓉酸性糖CLP2中含有的单糖主要为鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖以及半乳糖。肉苁蓉中多糖的DPPH自由基清除实验和总抗氧化能力实验结果表明，肉苁蓉中性糖CLP1的抗氧化能力高于肉苁蓉粗多糖CLP和肉苁蓉酸性糖CLP2。

关键词：肉苁蓉；多糖物质；成分分析；抗氧化活性；吸光度

中图分类号：TS201.23      文献标志码：A     文章编号：1000-9973（2023）05-0071-04

Abstract： In this paper， polysaccharides are extracted from Cistanche deserticola， Cistanche deserticola crude polysaccharide CLP is purified by DEAE cellulose column chromatography， and neutral sugar CLP1 and acidic sugar CLP2 of Cistanche deserticola are obtained. The content of total sugar， uronic acid and protein in Cistanche deserticola crude polysaccharide CLP， Cistanche deserticola neutral sugar CLP1 and Cistanche deserticola acidic sugar CLP2 is determined by UV spectral scanning， and the molecular weight and monosaccharide composition of polysaccharides are determined. At the same time， the DPPH radical scavenging capacity and total antioxidant capacity of Cistanche deserticola crude polysaccharide CLP， Cistanche deserticola neutral sugar CLP1 and Cistanche deserticola acidic sugar CLP2 are analyzed. The measured data show that the components of Cistanche deserticola crude polysaccharide CLP， Cistanche deserticola neutral sugar CLP1 and Cistanche deserticola acidic sugar CLP2 are similar， but there are great differences in their content. Multiple elution peaks can be obtained when Cistanche deserticola neutral sugar CLP1 and Cistanche deserticola acidic sugar CLP2 are separated and purified by DEAE cellulose chromatographic column， and the molecular weight distribution is 0～10 000 Da， indicating that the main components of Cistanche deserticola polysaccharides are small molecular sugars. The monosaccharide determination results of Cistanche deserticola neutral sugar CLP1 show that the monosaccharides in Cistanche deserticola neutral sugar CLP1 are mainly mannose， galacturonic acid， glucose， galactose and arabinose. The monosaccharide determination results of Cistanche deserticola acidic sugar CLP2 show that the monosaccharides in  Cistanche deserticola acidic sugar CLP2 are mainly rhamnose， galacturonic acid， glucose and galactose. The results   of DPPH radical scavenging experiment and total antioxidant capacity experiment of polysaccharides from Cistanche deserticola show that the antioxidant capacity of Cistanche deserticola neutral sugar CLP1 is higher than that of Cistanche deserticola crude polysaccharide CLP and Cistanche deserticola acidic sugar CLP2.

Key words： Cistanche deserticola; polysaccharides; component analysis; antioxidant activity; absorbance

肉苁蓉是一种草本寄生植物，含有大量的酚苷、生物碱、苯乙醇苷、糖以及醇，其中糖类物质主要为多糖形式，肉苁蓉多糖具有较强的免疫活性调节功能[1-2]。自由基作为人体生命活动中的中间代谢产物，处于不稳定状态，且具有较高的氧化活性强度，会造成人体内生物大分子物质组织器官损伤，因此利用天然抗氧化物质清除自由基成为当前食品研究的主要方向，肉苁蓉中的多糖物质成分具有较强的抗氧化能力，能够促进人体内自由基的清除[3]。

本文以肉苁蓉为研究对象，对其中的多糖物质进行提取分类，采用高效凝胶渗透色谱法对肉苁蓉多糖物质分子量进行测定，同时对多糖物质成分组成进行深入分析，通过测定肉苁蓉多糖成分的自由基清除能力和总抗氧化能力，对肉苁蓉的抗氧化活性进行分析，为肉苁蓉的开发利用和附加价值提升提供理论依据。

1 肉苁蓉样品制备与多糖物质提取

称取肉苁蓉2.5 kg，切片后加入12.5 L蒸馏水煮沸3 h，煮沸后过滤收集滤液，加入浓度为75%的乙醇静置24 h，使用离心机在4 000 r/min转速下离心30 min，收集沉淀物，将沉淀物冷冻后干燥处理，得到肉苁蓉粗多糖CLP[4]。取DEAE纤维素，浸泡溶胀后进行脱气处理，装入DEAE纤维素阴离子交换色谱柱，采用蒸馏水和NaCl溶液进行平衡。称取100 mg肉苁蓉粗多糖CLP溶解于10 mL蒸馏水中，蒸馏水洗脱后收集洗脱液并进行浓缩冷冻干燥，得到肉苁蓉中性糖CLP1；NaCl溶液洗脫后收集洗脱液，经透析后进行浓缩冷冻干燥，得到肉苁蓉酸性糖CLP2[5]。

将肉苁蓉中性糖CLP1和肉苁蓉酸性糖CLP2分别制备成浓度为1 mg/mL的多糖溶液，使用210～600 nm的分光光度计进行紫外光谱扫描，当260～280 nm处出现峰值时，证明溶液中含有蛋白质和核酸[6]。

2 肉苁蓉多糖物质成分测定

使用苯酚-硫酸法测定肉苁蓉样品中的总糖含量。分别量取浓度为0.1 mg/mL的葡萄糖溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1 mL置于玻璃试管中，加入蒸馏水定容至1 mL，然后向试管中分别加入浓度为6%的苯酚试剂0.5 mL和浓硫酸2.5 mL，振荡摇匀后冷却至室温。使用分光光度计在490 nm处测量吸光度，以糖含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，并计算出回归方程[7-8]。

使用考马斯亮蓝法测定肉苁蓉样品中的蛋白质含量。取不同浓度的标准品和浓度为0.1 mg/mL的样品溶液1 mL，分别向每个试管中加入4 mL考马斯亮蓝溶液，振荡摇匀后静置，使用分光光度计测量495 nm处的吸光度，根据标准曲线方程计算样品中的蛋白质含量[9]。

使用间羟基联苯法测定肉苁蓉样品中的糖醛酸含量。取不同浓度的标准品和浓度为0.1 mg/mL的样品溶液0.4 mL，向试管中加入2.5 mL浓硫酸，振荡摇匀后进行25 min沸水浴，取出后冷却至室温，向试管中加入浓度为0.3%的间羟基联苯和浓度为0.5%的氢氧化钠溶液，振荡摇匀后放置30 min，使用分光光度计测量525 nm处的吸光度，根据标准曲线方程计算样品中的糖醛酸含量[10-11]。使用高效凝胶色谱仪测定肉苁蓉多糖相对分子量，使用高效液相色谱仪测定肉苁蓉单糖组成[12]。

3 肉苁蓉多糖物质成分测定结果与分析

210～600 nm的光度计紫外光谱扫描曲线图见图1。

由图1可知，肉苁蓉中性糖CLP1在280 nm处出现明显吸收峰，肉苁蓉酸性糖CLP2在260～280 nm处虽没有明显吸收峰，但是紫外吸收谱线较高。由于蛋白质中含有的色氨酸和酪氨酸在280 nm条件下对紫外线有较大的吸收值，因此可以判断肉苁蓉中性糖CLP1中含有糖蛋白，无法判断肉苁蓉酸性糖CLP2中是否含有核酸和蛋白质。

DEAE纤维素阴离子交换色谱柱层析能够将离子型的物质和杂质吸附于色谱柱上，实现多糖物质的分离，将蒸馏水洗脱液浓缩干燥后，得到肉苁蓉中性糖CLP1共34.68 mg，使用NaCl溶液洗脱浓缩干燥后，得到肉苁蓉酸性糖CLP2共16.52 mg。实验过程中得出肉苁蓉总糖含量标准曲线方程、蛋白质含量标准曲线方程以及糖醛酸标准曲线方程。测量得出肉苁蓉总糖、蛋白质以及糖醛酸含量，见表1。

测定标准样品分子量和出峰面积，可以得出回归方程，将待检测样品的光射信号值代入回归方程，可以得出待检测样品分子量，进一步分析计算可以得出肉苁蓉中性糖CLP1和肉苁蓉酸性糖CLP2数均分子量、重均分子量以及分散系数。肉苁蓉中性糖CLP1和肉苁蓉酸性糖CLP2高效凝胶渗透色谱图保留峰测定时间与分子量计算结果见表2。其中数均分子量用来表示测定分子的大小，重均分子量与数均分子量的比值用来表示分子分布宽度。

由表2可知，肉苁蓉中性糖CLP1和肉苁蓉酸性糖CLP2的分子量分布区间为0～10 000 Da，由此说明肉苁蓉中的多糖为分子不同的小分子多糖，分子量呈现出不均一性，由此推断出肉苁蓉中性糖CLP1和肉苁蓉酸性糖CLP2是若干种多糖物质组成的混合物。

9种单糖标准样品和肉苁蓉中性糖CLP1以及肉苁蓉酸性糖CLP2的高效液相色谱峰及出峰保留时间见表3。将出峰时间进行对比，可以得出肉苁蓉中性糖CLP1中存在明显的5种单糖，肉苁蓉酸性糖CLP2中存在明显的4种单糖。肉苁蓉中性糖CLP1和肉苁蓉酸性糖CLP2中单糖占比见表4。

水解后的肉苁蓉中性糖CLP1单糖含量与肉苁蓉酸性糖CLP2单糖含量差异较大，其中肉苁蓉中性糖CLP1中葡萄糖含量高达88.62%，肉苁蓉酸性糖CLP2中葡萄糖含量仅为9.99%，肉苁蓉酸性糖CLP2中的半乳糖醛酸、半乳糖以及鼠李糖含量均超过5%。

4 肉苁蓉多糖物质抗氧化活性分析

在进行肉苁蓉多糖物质抗氧化实验分析时，将肉苁蓉多糖配制成浓度为0，0.25，0.5，1.0，2.0，4.0 mg/mL的肉苁蓉多糖溶液，对溶液的DPPH自由基清除率和总抗氧化能力进行测定。肉苁蓉多糖溶液的DPPH自由基清除率测定过程中，向溶液中加入浓度为2×10-4 mol/L的DPPH共2 mL，混合均匀后，在避光条件下放置15 min，对溶液进行离心处理，离心机转速为4 000 r/min，离心时间为15 min。使用分光光度计测定溶液在517 nm波处的吸光值，由此可以得出肉苁蓉多糖溶液的DPPH自由基清除率[13]，见表5。

由表5可知，肉苁蓉粗多糖CLP和肉苁蓉中性糖CLP1对DPPH自由基的清除率明显高于肉苁蓉酸性糖CLP2对DPPH自由基的清除率。当溶液浓度小于2.0 mg/mL时，肉苁蓉粗多糖CLP和肉苁蓉中性糖CLP1的DPPH自由基清除率随着浓度的增大而逐渐增强，最后平稳。

肉苁蓉多糖总抗氧化能力测定过程中，使用抗氧化能力检测试剂盒进行快速检测。取Trolox标准检测溶液，使用蒸馏水将Trolox标准检测溶液分别稀释至0，0.25，0.5，1.0，2.0，4.0 mg/mL，在检测孔板中加入过氧化物酶工作液，再加入待检测样品或标准检测液，最后加入快速检测试剂盒工作液，混合均匀后静置6 min，使用酶标仪在405 nm和734 nm波长处进行测定，由此得出肉苁蓉多糖总抗氧化能力[14-15]。肉苁蓉多糖物质溶液的总抗氧化能力测试结果见表6。

由表6可知，当肉苁蓉溶液浓度小于4.0 mg/mL时，肉苁蓉粗多糖CLP、肉苁蓉中性糖CLP1以及肉苁蓉酸性糖CLP2的总抗氧化能力随着溶液浓度的升高而增强；肉苁蓉中性糖CLP1的抗氧化能力明显高于肉苁蓉粗多糖CLP和肉苁蓉酸性糖CLP2的抗氧化能力。

5 结论

肉苁蓉多糖的高效凝胶渗透色谱法分析结果表明，其中含有的多糖分子量不大于10 000 Da，且含有多个洗脱峰，肉苁蓉多糖具有一定的抗氧化性。本文分析研究结果为肉苁蓉的深入开发利用奠定了基础。

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