添加红曲对乳酸发酵剂发酵性能的影响研究

卓经纬 彭诗泳 覃丽 杨琪 毛瑞丰

摘要：乳酸发酵是加工新鲜果蔬、制作泡菜的主要方法，发酵剂的性能直接影响最终产品的品质和安全性。该研究通过测定乳酸发酵剂发酵过程中乳酸菌活菌数、发酵酸度、产酸能力、蔗糖和葡萄糖浓度的变化，对腐败菌的抑制作用和亚硝酸盐的降解率等指标进行研究。结果表明，添加红曲米的乳酸发酵剂各方面性能均得到了改善，与对照组相比，添加4%红曲的实验组活菌数为1.245×108 CFU/mL，高于对照组33.7%，TAC为6.70 g/L，高于对照组25.7%，蔗糖含量比对照组低89.4%，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑菌圈的直径比对照组大，分别约75%和55.5%，亚硝酸盐降解率高于对照组12.1%，证明红曲对乳酸发酵剂主要性能的提升能起到显著的作用。该研究结果可为改良乳酸发酵剂、研发红曲乳酸发酵剂提供实验基础。

关键词：乳酸发酵；乳酸菌；红曲米；红曲霉；液相色谱

中图分类号：TS201.3      文献标志码：A     文章编号：1000-9973（2023）05-0065-06

Abstract： Lactic acid fermentation is the main method for processing fresh fruit and vegetables and making pickles. The performance of the starter directly influences the quality and safety of the final product. In this study， the inhibition effect on spoilage bacteria and the nitrite degradation rate are studied by determining the changes of the number of viable lactic acid bacteria， fermentation acidity， acid-production capacity， sucrose and glucose concentrations during the fermentation of lactic acid starter. The results show that the properties of lactic acid starter with red yeast rice are improved. Compared with the control group， the number of viable bacteria in the experimental group with 4% red yeast rice is 1.245×108 CFU/mL， which is 33.7% higher than that of the control group. TAC is 6.70 g/L，which is 25.7% higher than that of the control group. Sucrose content is 89.4% lower than that of the control group. The diameters of inhibition zones against Escherichia coli and Staphylococcus aureus are 75% and 55.5% greater than those of the control group respectively， and the nitrite degradation rate is 12.1% higher than that of the control group， which proves that red yeast rice can play a significant role in improving the main performance of lactic acid starter. The results can provide an experimental basis for the improvement of lactic acid starter and the development of red yeast rice lactic acid starter.

Key words： lactic acid fermentation; Lactobacillus; red yeast rice; Monascus purpureus; liquid chromatography

收稿日期：2022-11-18

基金項目：广西重点研发计划项目（AE30500114）

作者简介：卓经纬（1994－），男，硕士，研究方向：食品微生物。

*通信作者：毛瑞丰（1964－），男，副教授，博士，研究方向：微生物学、生物化学。

泡菜是指以新鲜蔬菜为主要原料，经食用盐或食用盐水渍制等工艺加工而成的蔬菜制品[1]，具有原料种类丰富、制作成本低廉、感官风味独特、保藏食用方便等优点。《信南山》有云：“中田有庐，疆埸有瓜。是剥是菹，献之皇祖。”可知泡菜制作在我国拥有悠久的历史，如今在我国乃至于全世界均具有广泛的消费市场。

乳酸菌是能使糖发酵，并产生大量乳酸的细菌的通称。泡菜的制作主要以乳酸发酵为主，随着封闭环境内氧气的减少和乳酸菌的生长，生成大量的乳酸，导致pH值降低来抑制腐败微生物，并由乳酸及乳酸菌产生的还原酶来降解亚硝酸盐，从而达到安全食用的标准。

乳酸发酵作为新鲜果蔬加工方式中简单和合适的代表，一般利用的是果蔬本身菌群中的乳酸菌进行自然发酵，或投入单一乳酸菌发酵剂进行发酵[2]。自然发酵可以满足传统生产的需求，但发酵条件难以规范，且发酵周期长，品质参差不齐；投入乳酸菌发酵剂由于可以在发酵初期迅速提高乳酸菌数，形成优势菌群，主导泡菜发酵，明显缩短了发酵周期，简化了发酵难度，但也因此在发酵初期对蔗糖、果糖的利用率较低，产酸种类单一，风味较单调，pH值变化不平滑，且不易保持乳酸菌活菌数，控制发酵时间，无法形成后续对腐败微生物的抑制作用，代谢亚硝酸盐周期较长[3]。

红曲是将红曲霉（Monascus purpureus）接种于大米等淀粉类原料并经发酵的传统发酵产品。红曲在发酵过程中会产生色素、洛伐他汀及γ-氨基丁酸（GABA）等次生代谢物，被用作食品着色剂、降胆固醇和降压药物等，因此红曲具有很高的营养价值。同时，红曲作为果蔬发酵剂已有悠久的历史，以果蔬和红曲作为原料制作的红糟酸正是广西传统的泡菜种类。传统红糟酸发酵周期短，风味物质丰富，营养价值高，对蔗糖和果糖等的代谢更充分，但也存在优势菌群不明显，保质期较短的缺点。因此，考虑制作一种以乳酸菌为主的红曲复合发酵剂，利用微生物协同生长的特性改善发酵性能。已有研究证明广西大瑶山地区的红曲样品中与发酵相关的微生物如乳酸杆菌属（Lactobacillus）、醋酸杆菌属（Acetobacter）及片球菌属（Pediococcus）等丰度较大，体现了广西红曲作为发酵剂的优势[4]。

本文以添加不同浓度的红曲研磨物的培养基进行乳酸菌的发酵培养，对比乳酸菌单一培养和单独添加米浆的培养，对发酵过程中乳酸菌活菌数、发酵酸度、产酸能力、蔗糖和葡萄糖浓度的变化，以及该复合发酵对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用和对亚硝酸盐的降解率进行研究，评估添加红曲的乳酸菌发酵是否更有利于提高乳酸菌活菌数，缩短发酵时间，提高糖原的利用率，提升对腐败微生物的抑制作用和缩短分解硝酸盐及亚硝酸盐的时间，提升乳酸发酵性能。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

红曲米研磨物：米为籼稻米，购于广西来宾市武宣县，接种的红曲霉菌株保藏于本实验室；乳酸菌：购于安琪酵母股份有限公司；脱脂乳粉：购于新西兰乳品牌有限公司；大肠杆菌、金黄色葡萄球菌：保藏于本实验室。

1.1.2 试剂

主要实验试剂见表1。

1.1.3 培养基

所用培养基见表2。

1.2 仪器与设备

主要仪器与设备见表3。

1.3 方法

1.3.1 红曲米研磨物制作工艺

籼稻米→浸泡→清洗→蒸煮→放凉→接种→搅拌→发酵→清洗→干制→研磨→红曲米研磨物（以下简称红曲）。

1.3.2 操作要点

1.3.2.1 原料选择

选取放置时间短的籼稻米，浸泡12 h，经过清洗、蒸煮后，在恒温25 ℃的环境下摊开成2 cm的厚度放凉至30 ℃左右。

1.3.2.2 接种液制备

用20 mL无菌水洗脱保存的红曲霉菌种，按照培养体积的2%添加5%自制PDB培养基进行培养，于160 r/min、32 ℃条件下，摇床培养72 h。

1.3.2.3 接种发酵

加入籼稻米质量10%的接种液，翻拌使其充分混合，35 ℃培养10 d。

1.3.2.4 干制研磨

50 ℃慢速干燥、粉碎至80～100目。

1.3.3 样品的制备

将乳酸菌于30 ℃活化，然后用MRS液体培养基于37 ℃静置培养24 h。取培养基中的悬浊液，于4 ℃、8 000 r/min的条件下离心5 min，收集沉淀并用无菌生理盐水洗涤，重复3次后在相同条件下再次离心，取沉淀溶于无菌水中制成乳酸菌发酵种子液[5]。

分别配制1 L（质量分数2%）的白糖和1 L（质量分数1%）的脱脂乳粉，混匀。使用柠檬酸和小苏打将混合液的pH值调节至5.5，然后分装于500 mL三角瓶中，于121 ℃、15 min的条件下进行灭菌并冷却至35 ℃。然后接入4%（体积和质量比）乳酸菌发酵种子液并进行标号。1号加入5 mL无菌水，2号加入5 mL质量分数为10%的米浆，3号～5号分别加入5 mL质量分数为1%、2%、4%的红曲米研磨物，于35 ℃的条件下恒温培养48 h，并在0，8，16，24，36，48 h分别取样测定[5]。

1.3.4 样品中乳酸菌活菌数的测定

参照GB 4789.35—2016 中乳酸菌的计数方法。

1.3.5 样品产酸活力的测定

参照QB/T 4575—2013中产酸活力的测定方法，用pH计进行测定。

1.3.6 发酵酸度的测定

参照GB 12456—2021 中发酵酸度的测定方法，对其总酸（total acid，TAC）进行测定。

1.3.7 蔗糖和葡萄糖浓度的测定

参照GB 5009.8—2016中蔗糖和葡萄糖的测定方法，采用高效液相色谱进行检测，色谱条件为色谱柱：Waters Symmetry C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），以十八烷基硅烷鍵合硅胶为填充剂；流动相：乙腈∶水为70∶30；流速：1.0 mL/min；柱温：40 ℃；进样量：20 μL；检测器温度：40 ℃，等度洗脱；检测波长：250 nm。

标准品的制备：分别取蔗糖和葡萄糖标准品，精密称定，加水溶解制成0.2 mg/mL的溶液，过0.45 μm微孔滤膜装入样品瓶中。

样品的预处理：准确称取400.0～600.0 mg待测样品，加入30 mL 75%乙醇，倒入50 mL容量瓶中摇匀，超声30 min，再加入75%乙醇定容，超声30 min，冷却至室温后重新定容。在4 ℃、8 000 r/min的条件下离心15 min，取上清液，过0.45 μm微孔滤膜装入样品瓶中。

1.3.8 发酵剂抑菌活性的测定

分别选取作为指示菌株的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，接种于LB液体培养基中，于30 ℃、120 r/min的条件下恒温培养16 h。然后分别取100 μL发酵菌液，均匀涂布于MRS培养基上，待平板将菌液吸收后，分别将发酵剂点接于划定的区域中心，于30 ℃的条件下恒温培养48 h，观察平板抑菌圈情况[6]。

1.3.9 发酵剂降解亚硝酸盐能力的测定

参照GB 5009.33—2016中硝酸盐及亚硝酸盐的测定方法，以2%（体积比）的接种量，将发酵液接种于25 mL亚硝酸钠含量为125 μg/mL的MRS液体培养基中，对照组接种2%无菌蒸馏水，于37 ℃的条件下培养72 h[7]。然后测定培养液中亚硝酸钠的含量，并计算样品的亚硝酸盐降解率，计算公式如下：

亚硝酸盐降解率=初始亚硝酸钠含量－培养后亚硝酸钠含量初始亚硝酸钠含量×100%。

1.3.10 数据处理

所有数据点均为平行3组独立实验的“平均值±标准偏差”。使用Excel 2019和SPSS 25整理实验数据，采用Duncan分析P<0.05水平的差异显著性，在0.01水平进行Pearson相关性分析，由Origin 2021软件绘图。

2 结果与分析

2.1 发酵过程中乳酸菌活菌数的变化

乳酸菌作为果蔬乳酸发酵中的主要菌群，其对糖原和其他底物的利用率、发酵代谢产物风味提升以及发挥的抑菌和降解亚硝酸盐等作用，均与其活菌数呈正相关性[8]。因此，发酵剂发酵过程中乳酸菌的活菌数为反映其发酵性能的重要指标。发酵过程中各组样品的活菌数变化见图1。

在发酵开始的6 h内，乳酸菌的生长相对缓慢，属于生长的迟缓期和对数期前期；6～24 h的时间段为乳酸菌的对数生长期，其代谢开始活跃，可以看到较高浓度（4%）的红曲反而对乳酸菌的生长造成了少许抑制；24～36 h内，乳酸菌的生长进入稳定期，30 h时对照组的活菌数由初始值3.63×107 CFU/mL上升至1.04×108 CFU/mL，而1%红曲组和2%红曲组的活菌数分别上升至1.171×108 CFU/mL和1.273×108 CFU/mL，分别显著高于对照组12.6%和22.4%，此时4%红曲组的活菌数反而低于1%和2%组，考虑是因为乳酸菌生长进入对数期的时间较晚；36 h后，由于培养基营养物质的消耗，可利用的碳源和氮源不足，以及代谢产物积累的影响，乳酸菌的生长逐步进入衰亡期，而42 h时1%红曲组、2%红曲组和4%红曲组的活菌数分别为1.162×108，1.241×108，1.245×108 CFU/mL，分别高于对照组24.8%、33.2%、33.7%，显示为添加红曲研磨物后乳酸菌活菌数的下降曲线更缓，表明红曲霉能够利用并消耗部分乳酸菌的代谢产物，减少其对乳酸菌生长的抑制。同时考虑红曲霉的代谢产物或能被乳酸菌利用，此處有待后续进一步研究。

2.2 发酵过程中产酸活力和总酸的变化

乳酸菌本身的适宜生长pH值为5.5～6.0，偏酸性，在pH 3.0以上也能生长繁殖，加之其自身的代谢过程中会产生大量的乳酸、苹果酸等[8]，因此pH值和TAC是反映乳酸发酵过程是否正常、表征发酵菌株生长情况和发酵制品成熟程度的重要指标。发酵过程中各组样品的pH值和TAC变化分别见图2和图3。

发酵0～18 h内，对照组和红曲组的pH值均以较快的速率分别下降至3.65～3.8左右和3.11～3.45左右，18 h时1%、2%、4%红曲组的TAC值分别上升至5.72，5.99，5.75 g/L，分别高于对照组25.7%、31.6%、26.4%，与乳酸菌活菌数的变化呈对应关系，体现出发酵过程中乳酸菌利用培养基中的糖分生长并产生有机酸，使得TAC迅速提高；18 h后，对照组的pH值变化逐渐放缓并稳定在3.55～3.70左右，而红曲组的pH则继续降低并在24 h后稳定在2.72～2.8左右，其中1%红曲组的下降趋势较缓，考虑为红曲添加量较少的缘故，而1%、2%、4%红曲组的TAC值最终稳定在6.12，6.41，6.70 g/L，分别超过对照组16.6%、22.1%、25.7%，添加红曲后TAC显著提升（P<0.05），体现出红曲对单位时间内乳酸发酵产酸的影响显著。

2.3 发酵过程中蔗糖和葡萄糖浓度的变化

糖类作为乳酸发酵中的主要碳源，其含量变化是研究发酵过程中乳酸菌及其他微生物代谢变化的重要指标[9]，本实验选取蔗糖和葡萄糖含量作为指标，分别考察发酵过程中总糖和还原糖的变化规律。乳酸发酵过程中蔗糖含量的变化见图4。

在0～12 h内，蔗糖含量呈下降趋势，12～30 h内迅速下降，30 h后逐渐趋于稳定，参考活菌数和总酸的变化可能是此时在底物大量消耗和代谢产物不断积累的双重影响下，乳酸菌对蔗糖的利用受到限制，而1%、2%、4%红曲组的蔗糖含量较对照组分别降低了54.3%、70.2%、89.4%，对蔗糖的利用率大幅提高，说明红曲霉在消耗乳酸菌代谢产物方面的效果显著，极大降低了代谢产物的积累对乳酸菌发酵的影响。

发酵过程中葡萄糖含量的变化见图5。

在0～6 h内，培养基中的葡萄糖含量呈上升趋势，对照组的葡萄糖含量为2.32 g/L，这可能是由于在开始阶段乳酸菌在自身酶的作用下，将蔗糖降解为葡萄糖和果糖，从而导致培养基中葡萄糖含量在短时间内上升，而1%、2%、4%红曲组的葡萄糖含量较对照组分别高30.2%、44.4%、59.9%，说明在发酵初期红曲霉就已经对乳酸菌的酶系统产生了刺激，对乳酸菌的发酵起到良好的协同作用；在6～12 h内，乳酸菌对还原糖的利用率提高，大量转化成乳酸、苹果酸等有机酸，葡萄糖含量开始下降，在12 h后迅速下降，并在36～42 h时趋近于0 g/L，下降趋势陡于蔗糖含量，说明些时间段内发酵剂中还含有一定量不被乳酸菌所利用的非还原性糖，综合蔗糖含量的变化可发现，4%红曲组明显<2%红曲组<1%红曲组<对照组，推断此时利用非还原性糖的主要菌种为红曲霉，说明红曲霉本身在乳酸发酵中能起到独特的利用非还原性糖的作用[10]。此外根据实验结果判断，代谢产物的积累对乳酸菌消耗还原糖的影响并不明显，值得后续继续探究。

2.4 发酵剂对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑制能力的检测

由于环境、原材料等多种因素的影响，果蔬发酵在日常生活和加工生产中常出现由杂菌大量繁殖引起的腐败现象。Islam等［11］分离得到的乳酸菌具有广谱抑菌性，对食源性腐敗菌、致病菌具有较好的抑菌性能。在考虑提升和发挥乳酸菌发酵性能的同时，对引起腐败的微生物的抑制作用也是衡量发酵剂实用性和安全性的重要指标。其中，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作为常见的食源性致病微生物，分别是革兰氏阴性致病菌和阳性致病菌的代表。本实验选取大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作为衡量发酵剂抑菌能力的指示菌，通过测量抑菌圈直径，考察各组发酵剂对其的抑制作用。大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径见表4。

通过对菌饼直径的比较发现，添加红曲后的发酵剂随着红曲添加量的提升抑菌效果增强，这可以用乳酸菌的抑菌机理解释，其抑菌机理是在发酵过程中产生如有机酸、抗菌肽等抗菌物质，所以在乳酸菌活菌数更高、发酵活力更高的情况下，发酵剂对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用也越强。此外，红曲霉的代谢产物如红曲色素也能抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌中的杆状细菌，如肉毒梭状芽孢杆菌等。

2.5 亚硝酸盐降解率的检测

由于亚硝酸盐和二级胺类能合成N-亚硝胺（N-nitrosamines，NAs）这种极强的致癌物，因此被归类为2A类致癌物。在传统的果蔬发酵中，亚硝酸盐的存在严重制约了发酵时间的控制和发酵剂的保存，为改善发酵剂的性能和发酵工艺的生产条件，对亚硝酸盐的检测和去除必不可少。本实验针对发酵剂对亚硝酸盐的降解率进行探究，结果见表5。

对照组对亚硝酸盐的降解率约为72.49%，而1%、2%、4%红曲组对亚硝酸盐的降解率分别约为79.89%、82.21%、84.59%，分别提升了7.4%、9.7%、12.1%，显示了红曲对乳酸发酵剂降解亚硝酸盐性能的提升作用，根据pH值的大小和变化，说明降解亚硝酸盐能力强的发酵剂在发酵过程中的产酸能力也较强[12]。

3 结论

上述实验表明，与单一添加乳酸菌的发酵剂和单独加入米浆的乳酸菌发酵剂相比，添加红曲的发酵剂在发酵过程中能够提高乳酸菌活菌数，提升发酵酸度和产酸能力，提高对蔗糖的利用率和将蔗糖水解为还原糖的速率，增强了对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用，提高了对亚硝酸盐的降解效率，以4%红曲组与对照组相比，活菌数为1.245×108 CFU/mL，高于对照组33.7%，TAC为6.70 g/L，高于对照组25.7%，蔗糖含量比对照组低89.4%，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径比对照组大，分别约75%、55.5%，并与同时期的pH值出现了一定的正相关性，亚硝酸盐降解率高于对照组12.1%，证明红曲对乳酸发酵剂的主要性能提升能起到显著的作用。

考虑到发酵剂的研制中菌种的筛选和配比也是关键点，还应更多考虑复合发酵剂中各菌种之间的协同和拮抗效应，对乳酸菌进行进一步的分离、纯化和鉴定。本实验中选择的乳酸菌主要为球菌，就是为了避免如植物乳杆菌等对红曲霉菌强烈的拮抗作用[13]，避免出现复合发酵性能反而不如单一发酵的问题。

本研究旨在从发酵剂方面改善传统果实发酵食品，如传统红糟酸在生产和保藏中容易出现的一些问题：发酵慢、货架期短、安全性不稳定等，希望通过提升发酵剂的发酵性能来改善相关问题。

尽管对于投入实际生产，对乳酸菌、红曲霉以及它们的代谢产物间的作用机理也缺乏更深入的研究，但添加红曲米的乳酸发酵剂在提高果蔬发酵剂性能等方面具有广阔的研究和应用前景。本研究为红曲乳酸复合发酵剂的研发和后续果蔬发酵制品的研究及生产加工提供了参考，以期利用果蔬发酵为食品生产创造更多的经济附加价值。

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