红鳍东方鲀体表溃烂病优势菌的分离、鉴定及治疗

彭欢 黄宇希 黎睿君

摘 要：2021年11月，辽宁大连某养殖场红鳍东方鲀（Takifugu rubripes）出现死亡。通过对患病红鳍东方鲀病灶部位进行细菌分离培养、细菌革兰氏染色、以及细菌16S rDNA 序列分析，从患病红鳍东方鲀中共分离出3株优势菌且均为弧菌，分别为哈维弧菌（Vibrio harveyi）、大菱鲆源弧菌（V. scophthalmi）、费氏弧菌（Aliivibrio fischeri）。药敏检测结果表明，费氏弧菌对复方新诺明、氟苯尼考、多西环素3种抗生素敏感；大菱鲆源弧菌仅对恩诺沙星敏感；哈维弧菌对环丙沙星、复方新诺明、氟苯尼考、多西环素、恩诺沙星5种抗生素敏感。3种优势菌对16种抗生素的药物敏感实验结果表明3种优势菌均为多重耐药菌。结合药敏实验结果与相关研究，推荐联合多西环素与山苍子植物精油对红鳍东方鲀体表溃烂病进行防治。

关键词：红鳍东方鲀（Takifugu rubripes）；体表溃烂；优势菌；分离鉴定

2021年11月，大连地区某养殖场发生红鳍东方鲀（Takifugu rubripes）病害并有大量死亡，主要症状为患病鱼体表明显溃烂，形成圆斑，肌肉暴露。病鱼解剖后可见肝脏出血，肠胀气。笔者对患皮肤溃烂病的红鳍东方鲀进行了优势菌分离，并通过形态学观察、革兰氏染色、16S rDNA 序列分析对分离菌株进行鉴定，同时通过分离菌株的药敏检测结果为该病的防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

2021年11月，辽宁省大连市某养殖场养殖的红鳍东方鲀病鱼10尾被送至大连市海珍品疾病防控重点实验室检测，送检鱼体长约为15 cm左右。

细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；PCR试剂购自宝生物工程（大连）有限公司；药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 病鱼解剖与优势菌分离 将患病红鳍东方鲀体表用生理盐水冲洗3遍后，放置于已消毒的托盘中，无菌条件下解剖鱼体。分别在病鱼体表溃烂处、肠道内容物、肝脏、鳃、脾脏、腹腔黏液中沾取样本，于NA固体培养基平板划线接种，在28 ℃恒温培养箱中培养24 h。培养后在体表溃烂处、肠道内容物、鳃、腹腔黏液共分离到4株优势菌，将分离菌落分别在NA固体培养基平板上进一步纯化，于28 ℃恒温培养箱中培养12 h。

1.2.2 细菌鉴定 将纯化后的细菌进行革兰氏染色，置于光学显微镜（CX21FS1，奥林巴斯）下观察。用细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌DNA，使用16s rDNA通用引物，正向引物：5-AGAGTTGATCCTGGCTCAG-3；反向引物：5- TACGGCTACCTTGT TACGACTT-3［1］，扩增16 srDNA基因。

PCR 反应体系25 μL：DNA 模板1 μL，正向、反向引物各1 μL，rTaq DNA Polymerase 0.25 μL，10×PCR Buffer （Mg2+ Plus） 2.5 μL，dNTP Mix 1 μL，无菌纯水18.25 μL。

PCR 反应参数：94 ℃ 预变性5 min，94 ℃ 变性30 s，55 ℃ 退火30 s，72  ℃ 延伸1.5 min，35个循环；72  ℃ 延伸10 min；4 ℃ 保存。琼脂糖凝胶电泳检测 PCR产物，并将 PCR 产物送至上海生工生物工程股份有限公司进行测序，将测得的16S rDNA 序列信息在NCBI数据库中通过 Blast 检索比对分析。

1.2.3 药敏实验 采用常规 Kriby‐Bauer 纸片扩散法进行药敏试验。将分离菌株菌液涂布于NA平板上，用无菌镊子将药敏纸片贴于培养基表面，28 ℃恒温培养箱中培养12 h。用游标卡尺测量各种药物的抑菌圈直径，以判定菌株对抗生素的敏感性。

2 结果与分析

2.1 临床解剖结果

患病红鳍东方鲀体表明显溃烂，形成圆斑，肌肉暴露，鳍条和唇部出现溃烂。解剖后可见肝脏出血，肠胀气，肠炎较严重（见封三图1）。

2.2 细菌分离鉴定结果

2.2.1 革兰氏染色结果 革兰氏染色结果表明从体表溃烂处分离的优势菌1号、鳃分离的优势菌2号、肠道内容物分离的优势菌3号、腹腔黏液分离的优势菌4号均为革兰氏阴性菌。菌体为杆状，弯曲呈弧状（见封三图2）。

2.2.2 16S rDNA分离鉴定结果 将病鱼体表、鳃、肠、腹部中分离到的细菌进行纯化及扩培后，用细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌DNA。以细菌基因组DNA为模板，通过PCR扩增菌株的16S rDNA序列，电泳检测结果显示PCR产物在约1 500 bp处有明显的条带（图3）。扩增产物经过序列测定，并经NCBI基因序列比对结果表明，体表和鳃溃烂处分离的优势菌1号、2号均为哈维弧菌（Vibrio harveyi），腸道内容物分离的优势菌3号为大菱鲆源弧菌（Vibrio scophthalmi），腹腔黏液分离的优势菌4号为费氏弧菌（Aliivibrio fischeri）。

2.3 优势细菌的药敏实验

16种抗菌类药物敏感性实验结果表明，3种优势菌均为多重耐药菌。费氏弧菌对复方新诺明、氟苯尼考、多西环素3种抗菌药敏感，但对卡那霉素、青霉素、环丙沙星等9种抗生素耐药；大菱鲆源弧菌对庆大霉素敏感，但对青霉素、复方新诺明、阿莫西林等12种抗生素耐药；哈维弧菌对环丙沙星、复方新诺明、氟苯尼考、多西环素、四环素、恩诺沙星6种抗菌药敏感，但对氧氟沙星、庆大霉素、头孢他啶等10种抗生素耐药，详见表1。

3 讨论

本研究从患病红鳍东方鲀中共分离出3株优势菌且均为弧菌，分别为哈维弧菌（V. harveyi）、大菱鲆源弧菌（V. scophthalmi）、费氏弧菌（A. fischeri），推测红鳍东方鲀体表溃烂病由3种弧菌混合感染所引起。哈维弧菌是海洋微生物区系中的一员，同时也是海洋动物的致病菌之一。在适宜条件下，哈维弧菌可以大量繁殖，通过伤口和消化道感染，导致动物伤口肌肉溃烂化脓和内脏严重病变，引起动物死亡［2-4］。本实验从红鳍东方鲀的体表溃烂处和鳃均分离到哈维弧菌，且患病鱼体表溃烂形成圆斑，表明了哈维弧菌对养殖红鳍东方鲀同样可以引起皮肤溃烂症状，这与目前哈维弧菌的致病机制研究一致。本研究中从患有肠胀气和肠炎的红鳍东方鲀肠道内容物里分离出大菱鲆源弧菌，大菱鲆源弧菌最早由西班牙学者自养殖大菱鲆仔鱼肠道中分离并鉴定为弧菌属细菌的一个新种，而之前的研究表明，可引发腹水症、肠炎病等［5-6］。费氏弧菌是一种生长在海洋中的革兰氏阴性菌，是某些海洋鱼类的致病菌［7］，研究发现当菌群密度达到一定阈值时费氏弧菌会产生集体发光现象，任何对细胞代谢机制的抑制作用都会导致其发光的减少，所以费氏弧菌目前被普遍作为环境测试指标［8］。因此，我们推测3种弧菌在红鳍东方鲀体表溃烂病发病过程中均发挥了重要作用，关于3种优势菌回归感染实验将进一步开展。

根據药敏实验结果显示，费氏弧菌对复方新诺明、氟苯尼考、多西环素3种抗菌药敏感，对氟苯尼考最敏感，抑菌圈直径为26 mm；哈维弧菌对环丙沙星、复方新诺明、氟苯尼考、多西环素、四环素、恩诺沙星6种抗菌药敏感，对环丙沙星最敏感，抑菌圈直径为26 mm；大菱鲆源弧菌仅对庆大霉素敏感，抑菌圈直径为19 mm，可以看出大菱鲆源弧菌在3种优势菌中表现出最强的耐药性，我们推测大菱鲆源弧菌因分离自肠道，红鳍东方鲀养殖周期较长，这与养殖过程中抗生素的频繁使用，造成分离的肠道细菌具有非常强的耐药性。为了进一步控制该疾病，我们推荐了联合植物精油进行该病的防治，目前的研究表明富含芳香醛、芳香酚和柠檬醛等成分的植物精油能够很好地抑制大菱鲆弧菌［9］。关于大菱鲆源弧菌的耐药机制值得进一步研究，有研究表明大菱鲆源弧菌临床分离株均能产生生物被膜［1］，这可能也与其耐药性有关。为此，根据药敏实验结果，推荐使用抗菌谱广、抗全身性感染和安全性较高的盐酸多西环素粉（水产用）药物进行拌料投喂来治疗红鳍东方鲀体表溃烂病。具体治疗方案为，每1 kg鱼体重投喂20 mg盐酸多西环素粉，每日1次，同时日粮中添加0.1%山苍子精油，连续用药5 d。值得一提的是，长期以来，由于基层从业人员对于抗生素的使用缺乏正确认识，导致大量的滥用和误用抗生素。建议生产部门在紧急使用抗生素前，针对优势病原开展药敏实验，根据药物敏感实验结果精准用药，同时联合使用中草药治疗相关疾病。

参考文献：

[1]

崔惠敬，孟玉霞，冯文倩，等.养殖大菱鲆肠道中大菱鲆弧菌的分离鉴定及药敏试验[J].水产科学，2017，36（2）：125-131.

[2] 杨行，章翔，龙昊，等.假交替单胞菌对哈维氏弧菌拮抗作用初探[J].水产科学，2019，38（6）：833-838.

[3] 郭伟良，陈永贵，邓恒为，等.大黄与抗生素体外协同抗哈维氏弧菌研究[J].水产科学，2018，37（6）：735-741.

[4] 孙鲲.哈氏弧菌种特异性分子标记的发现及其在哈氏弧菌快速诊断和免疫防治中的应用[D].青岛：中国科学院研究生院（海洋研究所），2009．

[5] 张超，王讷言，杨晓宇，等.一例红鳍东方鲀皮肤溃烂病的诊治[J].科学养鱼，2016（12）：64-65.

[6] CERD-CULLAR M，ROSSELL-MORA R A，LALUCAT J，et al.Vibrio scophthalmi spnov，a new species from turbot （Scophthalmus maximus）[J].International Journal of Systematic Bacteriology，1997，47（1）：58-61．

[7] MILLER M B，BASSLER B L.Quorum sensing in bacteria[J].Annual Review of Microbiology，2000，55（1）：165-199.

[8] 罗巅辉，王文妍，岳俊阳，等.海洋费氏弧菌培养条件的研究[J].环境科学与技术，2010，33（8）：20-23.

[9] 崔惠敬，孟玉霞，徐永平，等.植物精油对大菱鲆弧菌的体外和体内抗菌活性[J].微生物学通报，2017，44（2）：274-284.

Isolation，identification and treatment of dominant bacteria of Takifugu rubripes skin ulceration disease

PENG Huan，HUANG Yuxi，LI Ruijun

（ College of Fisheries and Life Science，Liaoning Key Laboratory of Marine Animal Immunology，

Dalian Key Laboratory of Marine Animal Disease Control and Prevention，Dalian Ocean University，Dalian 116023，China）

Abstract：In November 2021，Takifugu rubripes emerged skin ulceration disease in an aquaculture farm located in Dalian，Liaoning Province. After dissection of diseased T. rubripes，hemorrhaging liver ，flatulence intestinal and severe enteritis were observed. By bacterial isolation and culture，Gram staining，and bacterial 16S rDNA sequence analysis，three dominant strains of Vibrio were isolated and identified from infected T. rubripes. They were respectively Vibrio harveyi，Vibrio scophthalmi and Aliivibrio fischeri. The results of drug sensitivity test showed that A. fischeri was sensitive to three antibiotics， including compound sulfamethoxazole，florfenicol and doxycycline，respectively. V. scophthalmi could only be inhibited by enrofloxacin.In addition，ciprofloxacin，cotrimoxazole，florfenicol，doxycycline and enrofloxacin had antibacterial activity against V. harveyi. In the experiment of 16 antibiotics sensitivity test，the three dominant bacteria were all multi-drug resistant bacteria. Based on the results of drug sensitivity experiment and related studies，it is recommended to combine usage with doxycycline and Litsea cubeba plant essential oil to prevent and control the skin ulceration disease of T. rubripes.

Key words：Takifugu rubripes; body surface ulceration; dominant bacteria; isolation and identification

（收稿日期：2022-07-11）