一测多评法同时测定新复方大青叶片中4 种成分含量*

2023-05-26王丽琼魏长勇余敏灵

中国药业 2023年10期

王丽琼，魏长勇，余敏灵

（四川省乐山市食品药品检验检测中心·四川省药品监督管理局中药质量研究重点实验室，四川乐山 614000）

新复方大青叶片是由复方大青叶提取物、对乙酰氨基酚、咖啡因、异戊巴比妥和维生素C 组成的复方制剂。现行质量标准为原国家食品药品监督管理总局国家药品标准（WB3-B-1057-91-2015）［1］，但因维生素C 对照品性质不稳定［2-5］，未对其含量进行控制，且咖啡因和异戊巴比妥对照品存在需特殊购买和管理的问题。为此，本研究中采用乙醇代替甲醇（乙腈）作为流动相的有机相，建立了以对乙酰氨基酚为对照品，同时测定新复方大青叶片中4 种成分的一测多评（QAMS）法。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

1260 型高效液相色谱仪［含二极管阵列（DAD）检测器］、1100 型高效液相色谱仪（含紫外- 可见光检测器），均购自美国Agilent 公司；PE A-10 型高效液相色谱仪，含量DAD 检测器（珀金埃尔默企业管理有限公司）；XS205 型电子分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司，精度为0.01 mg）；KQ 5200DB 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药

新复方大青叶片（厂家S1，S2，S3，S4，S5，编号分别为A，B；C，D；E；F；G，规格均为每片含维生素C 10 mg、对乙酰氨基酚75 mg、咖啡因7.5 mg 和异戊巴比妥7.5 mg）；维生素C 对照品、对乙酰氨基酚对照品、咖啡因对照品（中国食品药品检定研究院，批号分别为100425 - 201504，100018 - 201610，171215 - 201010，含量分别为100.0%，99.9%，100.0%）；异戊巴比妥原料（厂家A，批号为W201102，含量为99.4%）；乙醇为色谱纯，磷酸、乙醇、磷酸二氢钾、焦亚硫酸钠均为分析纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Welch Ultimate LP - C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙醇（A）-0.01 mol/L 磷酸二氢钾溶液（B，用磷酸调pH 至3.0），梯度洗脱（0～3 min时2%A，3～6 min 时2%A→15%A，6～15 min 时15%A，15～20 min 时15%A→60%A，20～26 min 时60%A，26～27 min 时60%A→2%A，27～32 min 时2%A）；流速：0.8 mL/min；检测波长：215 nm（对乙酰氨基酚、咖啡因和异戊巴比妥）和245 nm（维生素C）；柱温：40 ℃；进样量：10 μL。

2.2 溶液制备

分别取维生素C、对乙酰氨基酚、咖啡因对照品和异戊巴比妥原料32.16，187.06，18.66，19.06 mg，精密称定，置同一50 mL容量瓶中，加少量无水乙醇溶解，再加0.5%焦亚硫酸钠溶液（用磷酸调pH 至3.0，下同）稀释、定容、摇匀，即得混合对照品贮备液；精密量取1 mL，置20 mL 容量瓶中，加0.5%焦亚硫酸钠溶液稀释、定容，摇匀，即得混合对照品溶液。取样品20片（糖衣片除去包衣），研细，取约0.1 g，精密称定，置100 mL 容量瓶中，加0.5%焦亚硫酸钠溶液适量，超声（功率200 W、频率40 kHz，下同）处理10 min，再加0.5%焦亚硫酸钠溶液稀释、定容、摇匀，即得供试品溶液。

2.3 方法学考察

系统适用性试验：取2.2项下混合对照品溶液和供试品溶液各适量，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果供试品溶液色谱中，在与混合对照品溶液色谱相应位置处有吸收峰，理论板数按各成分峰计均应大于3 000，分离度均大于1.5。详见图1。

图1 高效液相色谱图1.Vitamin C 2.Paracetamol 3.Caffeine 4.AmobarbitalA.Mixed reference solution B.Test solutionFig.1 HPLC chromatograms

线性关系考察：精密量取2.2项下混合对照品溶液2，4，8，12，16，20 μL，按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以待测成分进样量（C，μg）为横坐标、峰面积（A）为纵坐标进行线性回归，得维生素C、对乙酰氨基酚、咖啡因、异戊巴比妥的回归方程分别为A1=3 627.24C1（r=0.999 8），A2=2 036.51C2（r=0.999 7），A3=5 570.84C3（r=0.999 9），A4=2 467.71C4（r=0.999 9）。结果表明，4种成分进样量分别在0.064 3～0.643 2 μg、0.373 7～3.737 5 μg、0.037 3～0.373 2 μg、0.037 9～0.378 9 μg范围内与峰面积线性关系良好。

检测限与定量限考察：取维生素C、对乙酰氨基酚、咖啡因和异戊巴比妥对照品各适量，精密称定，加无水乙醇，制成质量浓度分别为1.21，7.48，3.81，8.17 μg/mL的溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，以信噪比（S/N）为3和10时的待测成分质量浓度分别记作检测限和定量限。结果检测限分别为0.03，0.15，0.07，0.24 μg/ mL，定量限分别为0.09，0.51，0.23，0.79 μg/mL。

精密度试验：取2.2 项下混合对照品溶液适量，按2.1项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果维生素C、对乙酰氨基酚、咖啡因和异戊巴比妥峰面积的RSD分别为1.02%，0.92%，1.09%，0.78%（n= 6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取2.2 项下供试品溶液适量，分别于室温下放置0，2，4，8，16，24 h时按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果维生素C、对乙酰氨基酚、咖啡因和异戊巴比妥峰面积的RSD分别为1.58%，1.08%，0.97%，0.85%（n=6），表明供试品溶液在室温下放置24 h内基本稳定。

重复性试验：取样品（编号A）适量，按2.2项下方法制备供试品溶液，共6 份，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算含量。结果维生素C、对乙酰氨基酚、咖啡因和异戊巴比妥的平均含量分别为70.31%，89.37%，93.87%，89.72%，RSD分别为1.50%，1.72%，0.79%，1.21%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知含量的样品（编号A，维生素C、对乙酰氨基酚、咖啡因和异戊巴比妥的平均含量分别为22.461 0，217.828 8，21.985 1，21.840 2 mg/ g），取细粉各适量（约0.05 g），共6份，置100 mL容量瓶中，精密加入2.2 项下混合对照品贮备液2.5 mL，按2.2 项下方法制备供试品溶液。按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并采用外标法（ESM）计算回收率。结果见表1。

表1 加样回收试验结果（n=6）Tab.1 Results of the recovery test（n=6）

2.4 相对校正因子（f）的确定和耐用性考察

f的确定：精密量取2.2 项下混合对照品溶液适量，共3 份，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以对乙酰氨基酚为参照，采用斜率法计算维生素C、咖啡因和异戊巴比妥的f，f=Kr/Kt，式中，Kr为对乙酰氨基酚的斜率，Kt为其他待测成分的斜率。计算3 个成分f的平均值。结果维生素C、咖啡因和异戊巴比妥的f分别为0.576 1，0.373 2，0.843 8，RSD分别为0.91%，0.51%，0.62%（n=3）。

耐用性考察：精密量取2.2项下混合对照品溶液适量，按2.1项下色谱条件［分别设置色谱柱为Agilent Extend - C18柱、Welch Ultimate LP - C18柱、A585V3 SVEATMC18Opal 柱、GL Sciences Intersustain AQ - C18柱、Waters AtlantisTMT3 柱（规格均为250 mm × 4.6 mm，5 μm）］测定，记录峰面积，计算维生素C、咖啡因和异戊巴比妥的f，结果见表2。可见，色谱柱发生一定程度变化时，各成分f的RSD均小于3%，耐用性较好。

表2 耐用性考察结果Tab.2 Results of the durability test

2.5 QAMS 法与外标法测定结果比较

取样品（编号A - G）适量，按2.2 项下方法制备供试品溶液，均平行3 份，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积，分别采用ESM 和QAMS 法计算样品含量。QAMS法计算公式为mt=（f×At×As）/ms，式中，mt为待测成分（维生素C、咖啡因和异戊巴比妥）的质量（μg），At为式中待测成分的峰面积，ms与As分别为对乙酰氨基酚的质量（μg）与峰面积。对2种方法所得结果采用配对t检验，结果均无显著差异（P＞0.05），详见表3。

表3 样品含量测定结果（%）Tab.3 Results of content determination of vitamin C，caffeine，amobarbital and paracetamol in samples（%）

3 讨论

3.1 样品溶剂选择

预试验中比较了0.5%焦亚硫酸钠溶液及0.5%焦亚硫酸钠溶液-乙醇（95∶5、90∶10、80∶20，V/V）这4 种溶剂对4个成分提取效率的影响。结果，4种溶剂提取效率基本一致，乙醇对对乙酰氨基酚、咖啡因、异戊巴比妥的提取均无影响，综合考虑，溶剂最终选择0.5%焦亚硫酸钠溶液。

3.2 检测波长选择

预试验中所得紫外光谱图显示，维生素C在245 nm波长处有最大吸收，咖啡因和异戊巴比妥在215 nm 波长处有较大吸收，综合考虑，选择检测波长为215 nm（对乙酰氨基酚、咖啡因和异戊巴比妥）和245 nm（维生素C）。

3.3 流动相与柱温选择

预试验中比较了流动相B分别为水、0.01%磷酸溶液、0.01 mol/L 磷酸二氢钾溶液（用磷酸调pH 至3.0）对色谱峰的影响。结果采用水作为流动相时，维生素C出峰时间延迟，峰形差，展宽，而在酸性条件下，维生素C出峰时间适中，峰形好。经考察，选择0.01 mol/L 磷酸二氢钾溶液（用磷酸调pH 至3.0）时，4个成分峰与相邻峰的分离度符合要求。4 种成分理化性质不一致，维生素C极性强，异戊巴比妥非极性强，采用梯度洗脱，各组分出峰时间适中，峰间分离度好。乙醇黏度较大，适当升高柱温可降低黏度，经考察，柱温选择40 ℃。

3.4 维生素C 稳定性考察

预试验中以维生素C 对照品加磷酸水溶液（pH 分别为2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5）及水，分别于室温下放置0，2，8，12，16，24，36 h 时进样测定，记录峰面积。发现维生素C 溶液稳定性pH 3.0 ＞pH 3.5 ＞pH 2.5 ＞pH 4.0 ＞pH 4.5 ＞pH 2.0 ＞水。故选择制备pH 3.0 的磷酸水溶液。还分别用0.3%，0.5%，0.7%焦亚硫酸钠溶液制备供试品溶液，分别于0，4，8，12，16，24 h 时进样测定。结果发现焦亚硫酸钠溶液体积分数为0.5%及以上时，维生素C稳定性较好。

3.5 方法的经济性与环保性

新复方大青叶片各成分中，异戊巴比妥和咖啡因属第二类精神药品，维生素C 性质不稳定（易氧化和水解），这3个成分对照品的购买和管理存在一定的问题。QAMS 法是以价廉易得、性质稳定的物质为内参物，建立内参物与其他成分间的f，并以此获得其他多个组分的含量［6-9］。该方法可解决药品质量控制中对照品性质不稳定、价格昂贵、需特殊购买和管理的问题，适用于复杂成分或多指标成分含量测定。课题组经过研究和验证，以性质稳定的对乙酰氨基酚为内参物，采用QAMS 法［10-16］，以f计算样品中维生素C、咖啡因和异戊巴比妥的含量。在后期检验过程中，仅需对乙酰氨基酚对照品，省去维生素C、咖啡因和异戊巴比妥对照品，实现检验方法的经济性发展。甲醇作为第二类溶剂在检验中被大量使用，对环境和实验人员身体健康影响均较大。乙醇属第三类溶剂，毒性较低，本研究中以乙醇作为流动相的组成部分较安全［17-20］。